[发明专利]一种利用三种糖基转移酶制备Globotriose-连接的活性糖肽的方法

权利要求书

1.一种利用三种糖基转移酶分步合成法制备含有Globotriose-连接活性糖肽的方法，步骤是：

(1)以含有N-X(X≠P)-T/S的N-糖基化位点的多肽为起始底物，利用N-糖基转移酶ApNGT合成Peptide-Glc活性糖肽；

(2)以获得的Peptide-Glc活性糖肽，利用β-1,4-半乳糖基转移酶LgtB合成Peptide-Glc-Gal活性糖肽；

(3)以获得的Peptide-Glc-Gal活性糖肽，利用α-1,4-半乳糖基转移酶LgtC合成制得Peptide-globotriose活性糖肽。

2.根据权利要求1所述利用三种糖基转移酶分步合成法制备含有Globotriose-连接活性糖肽的方法，其特征在于：所述含有N-X(X≠P)-T/S的N-糖基化位点的多肽选多肽DANYTK、多肽WPAVGNCSSALRW、多肽KYPALNVTMPN或多肽VLRVANITRLQ。

3.根据权利要求1所述利用三种糖基转移酶分步合成法制备含有Globotriose-连接活性糖肽的方法，其特征在于：所述的N-糖基转移酶ApNGT来自Actinobacilluspleuropneumoniae；所述的β-1,4-半乳糖基转移酶LgtB来自Neisseria meningitidesMC58；所述的α-1,4-半乳糖基转移酶LgtC来自Neisseria meningitides MC58。

4.根据权利要求1所述利用三种糖基转移酶分步合成法制备含有Globotriose-连接活性糖肽的方法，其特征在于：步骤(1)所述利用N-糖基转移酶ApNGT合成Peptide-Glc活性糖肽的步骤是：

1)按照终浓度计，以含有N-X(X≠P)-T/S的N-糖基化位点的多肽0.8～1.0mM，UDP-Glc8～10mM，pH 7.0～8.0的10～300mM HEPES缓冲液为反应体系，加入2～5mg/mL的N-糖基转移酶ApNGT；

2)置30-37℃水浴条件下，反应时间5～50h；

3)将反应后的混合液100℃处理5～8min终止反应，然后以12000r/min离心5～15min取反应上清液使用高效液相色谱(HPLC)按常规方式进行分析和纯化，洗脱样品使用旋转蒸发仪进行浓缩，产物冷冻干燥后即得Peptide-Glc活性糖肽。

5.根据权利要求4所述利用三种糖基转移酶分步合成法制备含有Globotriose-连接活性糖肽的方法，其特征在于：

步骤1)中，按照终浓度计，含有N-X(X≠P)-T/S的N-糖基化位点的多肽1.0mM，UDP-Glc10mM，pH8.0的10mM HEPES缓冲液为反应体系，加入4mg/mL的N-糖基转移酶ApNGT；

步骤2)中，所述水浴选30℃，反应时间选30h。

6.根据权利要求1所述利用三种糖基转移酶分步合成法制备含有Globotriose-连接活性糖肽的方法，其特征在于：步骤(2)所述利用β-1,4-半乳糖基转移酶LgtB合成Peptide-Glc-Gal活性糖肽的步骤是：

1)以制得的Peptide-Glc活性糖肽0.8～1.0mM，UDP-Gal 8～10mM，pH7.0～8.0的10～300mM HEPES缓冲液为反应体系，加入0.2～0.5mg/mL的β-1,4-半乳糖基转移酶LgtB；

2)置30-37℃水浴条件下，反应时间5～50h；

3)将反应后的混合液100℃处理5～8min终止反应，然后以12000r/min离心5～15min取反应上清液使用高效液相色谱(HPLC)按常规方式进行分析和纯化，洗脱样品使用旋转蒸发仪进行浓缩，产物冷冻干燥后即得Peptide-Glc-Gal活性糖肽。