[发明专利]细胞培养基、试剂盒及细胞培养方法

说明书

本发明提供了一种细胞培养基，所述细胞培养基由基础培养基、营养源、通路抑制成分、抗氧化成分、糖皮质激素、激活成分和促分化成分组成。所述基础培养基为DMEM/12，所述通路抑制成分中的转化生长因子‑β信号抑制剂和γ‑分泌酶抑制剂用于促进肝向分化，再配合所述糖皮质激素、由腺苷酸环化酶激活剂组成的所述激活成分以及由FH1(BRD‑K4477)、FPH1(BRD‑6125)或FPH2(BRD‑9424)组成的促分化成分，共同取代现有技术中的二甲基亚砜来进一步促进肝前体细胞的成熟分化，避免了由于二甲基亚砜的毒性容易引起细胞凋亡的问题，且有利于缩短细胞成熟的时间。本发明还提供了包括所述细胞培养基的试剂盒，以及应用所述试剂盒进行的细胞培养方法。

技术领域

本发明涉及细胞培养技术领域，尤其涉及细胞培养基、试剂盒及细胞培养方法。

背景技术

传统临床上治疗肝癌或肝硬化等恶性肝脏病变的主要手段是肝移植，但是由于肝供体缺乏、手术风险大、费用高以及容易发生免疫排斥等负面因素制约了肝移植手术技术的发展。近年来，以肝细胞移植以及生物人工肝为代表的肝细胞替代治疗，成为终末期肝病治疗研究的热点。

肝前体细胞(Hepatic Progenitor Cells，HPCs)是一类具有自我更新且增殖能力较强，并具有多向分化潜能的干细胞群，其表型特征接近肝细胞，能够直接参与肝脏的生长和发育，是肝细胞移植、细胞再生、研究病毒性肝炎发病机理以及抗病毒药物筛选研究方面的理想细胞来源。其中的人肝癌细胞系(HepaRG)是高度增殖的祖细胞系，具有同时分化成胆管细胞样细胞和肝细胞样细胞的潜力。而原代肝细胞来源的肝前体样细胞(Hepatocyte-derived liver progenitor-like cells，HepLPCs)在体外极易实现肝向分化，转变回功能性肝细胞。

现有技术中，例如2002年发表在Proceedings of the National Academy ofSciences ofthe United States ofAmerica(美国科学院院报)第99卷的“Infection of ahuman hepatoma cell line by hepatitis B virus”，采用含有较高浓度二甲基亚砜(Dimethyl Sulfoxide，DMSO)的培养基来诱导HepaRG的分化。然而，DMSO具有一定的毒性，容易引起细胞的凋亡，且分化时间至少长达28天，限制了肝前体细胞分化成熟技术的应用推广。

因此，有必要开发一种新型的细胞培养基以避免现有技术中存在的上述问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种细胞培养基，具有所述细胞培养基的试剂盒以及利用所述试剂盒进行的细胞培养方法，以促进不同类型肝前体细胞的分化和成熟，避免现有技术中由于使用DMSO诱导细胞分化而容易产生细胞凋亡的问题，同时缩短细胞分化成熟的时间，以利于肝前体细胞分化成熟技术的应用推广。

为实现上述目的，本发明的所述细胞培养基，由基础培养基、营养源、通路抑制成分、抗氧化成分、糖皮质激素、激活成分和促分化成分组成；所述基础培养基为DMEM/12培养基，所述营养源包括无血清细胞培养添加剂，所述通路抑制成分由转化生长因子-β信号抑制剂和γ-分泌酶抑制剂组成，所述激活成分为腺苷酸环化酶激活剂，以用于激活蛋白激酶A，所述抗氧化成分包括氮乙酰半胱氨酸，所述促分化成分为FH1(BRD-K4477)、FPH1(BRD-6125)或FPH2(BRD-9424)；所述营养源的体积占所述基础培养基体积的1％-2％；每1000克所述基础组合培养基中，所述通路抑制成分的质量为7×10^-4克-3×10^-2克，所述抗氧化成分的质量为3.5×10^-4克-1.1克，所述糖皮质激素的质量为2.3×10^-3克-5.8×10^-2克，所述激活成分的质量为8.2×10^-4克-2.1×10^-2克，所述促分化成分的质量为1.1×10^-3克-0.15克。