[发明专利]一种制备沙海蜇毒素抗毒血清的方法

权利要求书

1.一种沙海蜇毒素抗毒血清的制备方法，其特征在于：

沙海蜇毒素采用甲醛进行减毒，减毒处理后沙海蜇毒素的与弗氏佐剂混合进行动物免疫，期间不断进行效价检测，免疫后采血，离心制备兔血清；然后使用沙海蜇毒素特异偶联的CNBr-activated Agarose 4B亲和层析填料进行亲和层析对血清进行纯化，最终获得纯净沙海蜇毒素特异性抗体；

所述减毒处理为向沙海蜇毒素中加入浓度为35-40%甲醛并于37℃恒温箱中恒温反应5-7天；而后再次加入浓度为35-40%甲醛， 再于37℃恒温反应5-7天；随后透析除去甲醛，高速离心、过滤后将上清液保存于-80℃待用；所述的透析液为pH7.0，浓度为20-50 mM PBS；35-40%甲醛与毒素的体积比值为0.4%-6%；

所述离心获得抗毒血清使用沙海蜇毒素蛋白特异偶联的CNBr-activated Agarose 4B亲和层析填料进行层析纯化，进而得到沙海蜇毒素蛋白特异性免疫球蛋白抗体；

所述亲和纯化填料制备，先使用1-3mM HCl活化CNBr-activated Agarose 4B填料，再将其与沙海蜇毒素在20-50 mM Na₂CO₃碱性条件下，于4°C偶联 8-12h，即得到沙海蜇毒素偶联的CNBr-activated Agarose 4B亲和层析填料；

所述动物免疫：使用新西兰大白兔作为免疫动物，采用减毒后的沙海蜇毒素抗原与弗氏完全佐剂混合进行初免，初免后进行三次加强免疫，分别于初次免疫后 2 周、4 周、6 周使用沙海蜇毒素抗原与弗氏不完全佐剂免疫三次；所述减毒后的沙海蜇毒素抗原与弗氏完全佐剂或弗氏不完全佐剂体积比为1:0.8-1.2；

所述初免的免疫剂量为0.3-0.4mg/kg；初次免疫3周后进行第二次免疫，免疫剂量为0.15-0.2mg/kg；2周后进行第三次免疫，免疫剂量为0.15-0.2g/kg ，2周后进行第四次免疫，免疫剂量为0.15-0.2mg/kg；免疫结束后测定其效价。

2.按权利要求1所述的沙海蜇毒素抗毒血清的制备方法，其特征在于：所述层析纯化使用pH7.0, 20-50mM Na2PO4冲洗层析填料，加入上述获得抗毒血清，于4°C摇床过夜，弃上清液，最后使用pH=2.0-3.0,20-50mM甘氨酸洗脱填料，从而得到沙海蜇毒素蛋白特异性免疫球蛋白抗体。