[发明专利]一种用MALDI-TOF-MS测定ADAMTS-13酶活性的底物、方法及试剂盒

说明书

本发明属于医学分子生物学，蛋白多肽检测技术领域，尤其涉及一种能够利用MALDI‑TOF‑MS来检测金属蛋白酶ADAMTS‑13酶活性的底物、方法及试剂盒。包括以下步骤：(1)ADAMTS‑13酶切底物GST‑vWF82‑6XHis重组蛋白的表达纯化；(2)酶切反应；(3)ADAMTS‑13酶切产物被金属螯合芯片富集以后被MALDI‑TOF‑MS识别检测，并由分析软件得到血清样本中ADAMTS‑13的酶切活性。本发明的体外定量测定ADAMTS‑13酶活性的底物、方法及试剂盒，灵敏度、准确性好，操作简便，价格便宜，适用于广泛病人筛查。

技术领域

本发明属于医学分子生物学，蛋白多肽检测技术领域，尤其涉及一种能够利用MALDI-TOF-MS来检测金属蛋白酶ADAMTS-13酶活性的底物、方法及试剂盒。

背景技术

MALDI-TOF-MS(基质辅助激光解吸离子化飞行时间质谱)主要有三部分组成：第一部分是金属载片，可以定向选择为金属螯合芯片，第二部分是飞行时间质谱仪，也可以称做质谱阅读器，第三部分是系统专用分析软件。

本检测方法将采用金属螯合芯片载片，金属螯合芯片表面可以螯合正二价金属离子Ni，可以特异性的捕获带有组氨酸基团的蛋白质多肽。

质谱阅读器，就是基质辅助激光解析电离飞行时间质谱仪。其通过激光脉冲辐射将样品转化为运动的气态离子并按质荷(M/Z)大小进行分离，根据不同质荷比在电场中飞行时间长短不一，从而绘制出一张质谱图。

系统专用分析软件用来处理实验所得的数据。通过对获取数据进行计算分析，从而定量导出计算 ADAMTS-13酶活性的准确数值。

MALDI-TOF-MS技术操作步骤可以分为以下几步：

1、被分析的样品直接点样到芯片阵列进行反应，样品中的蛋白多肽特异性结合到芯片上进行反应；

2、芯片冲洗，把未结合和非特异性结合的小分子物质洗脱掉，从而除去样品中的“噪声”，降低背景；

3、在芯片上加基质，当激光照射芯片时，它能把激光的能量转化为热能；

4、样品中的蛋白多肽吸收能量后，被解吸而发生离子化，通过真空管飞到离子检测器，这样质荷比不同其飞行时间不同，所以不同的蛋白多肽即可根据质荷比而被分离。

血栓性微血管病(thrombotic microangiopathy，TMA)是一组具有共同病理特征的急性临床病理综合征，分为遗传性和获得性，主要表现为内皮细胞肿胀脱落、内皮下绒毛状物质沉积和血管腔内血小板聚集形成微血栓、血管腔内栓塞及红细胞碎裂等微血管系统异常。

TMA临床上主要表现为血小板减少、溶血性贫血和微循环中血小板血栓造成的器官受累，其临床表现与TMA的病变范围和累及不同器官造成的功能障碍有关。

该病涉及的临床科室非常广泛，患者往往可能在不同的科室，如肾脏内科、血液科、神经内科、妇产科、皮肤科、心血管内科和呼吸科等就诊，如接诊医生缺乏对该病的认识，往往会造成严重的误漏诊，故提高对该类疾病的认知度已成为目前国内外相关专业领域内的关注热点。