[发明专利]一种用MALDI-TOF-MS测定ADAMTS-13酶活性的底物、方法及试剂盒

权利要求书

1.一种体外定量测定ADAMTS-13酶活性的底物获得，其特征在于：包括vWF82 DNA片段的获得，以人脐静脉内皮细胞为质粒模板分别进行PCR扩增vWF82的DNA片段。设计引物序列如下：

正义链：

5_-cgggatccGACCACAGCTTCTTGGTCAGCC-3_，

反义链：

5_-cggaattcTCAGTGATGGTGATGGTGATGTCGGGGGAGCGTCTCAAAGTCC-3_.

两条引物分别引入BamHI和Hind m的酶切位点(小写英文字母部分)，并于C末端各插入一个6X His Tag(下划线部分)。

2.一种采用根据权利要求1所述底物的体外测定量测定ADAMTS-13酶活性的方法，其特征在于：包括以下步骤：

(1)ADAMTS-13酶切底物GST-vWF82-6XHis重组蛋白的表达纯化：

1.1.vWF的82个氨基酸片段D1587～R1668以及C末端6个组氨酸(6XHis)被插入到N端带有GST蛋白的细菌表达载体pGEX6p-1上；

1.2.挑选阳性克隆，并转染BL21表达细菌；

1.3.大量培养细菌，收集菌体，利用超声进行细菌裂解，高速离心以后收集上清，并加入等体积PBS缓冲液稀释；

1.4.通过GST亲和柱纯化蛋白，利用还原性谷胱甘肽进行洗脱，从而得到纯化的重组蛋白GST-vWF82-6XHis作为本技术需要用到的酶切底物；

1.5.取一定量的GST-vWF82-6XHis和切割蛋白酶Prescission Protease孵育，得到本技术在检测阶段需要用到的内参照；

(2)酶切反应：

需要用到以下试剂和仪器：

一组血清标准物，混合正常人血浆被系列稀释成100％，50％，20％，10％，5％以及2.5％，用来稀释的溶液配方如下：150mM NaCl，0.1％BSA，1XPBS；

高低对照，将PNP稀释成50％以及5％分别作为高低对照；

反应缓冲液：50mM Tris-Cl pH8.0，1mM BaCl₂，50mM NaCl；

芯片激活缓冲液：50mM NiSO₄；

芯片结合缓冲液：1XPBS；

芯片洗脱缓冲液：1XPBS，300mM NaCl，0.1％ Tween20；

能量吸收物质EAM：SPA(5mg溶于200ul 50％ACN，200ul 0.5％ TFA)；

金属螯合芯片重生缓冲液：50mM EDTA，50％ACN，0.5％ TFA；

纯净水；

震荡仪器；

各种型号加液枪；

2.1将酶切底物GST-vWF82-6XHis用反应缓冲液稀释到0.1ug/ul，取10ul血清标准物，高低对照以及病人血清样本同25ul稀释后的底物溶液混合；

2.2在37度水浴锅孵育1小时以后，加热到95度终止反应；与此同时配置内参照，将内参照用PBS稀释到0.01ug/ul；

(3)ADAMTS-13酶切产物被金属螯合芯片富集以后被MALDI-TOF-MS识别检测，并由分析软件得到血清样本中ADAMTS-13的酶切活性：

3.1金属螯合芯片激活，取需要的金属螯合芯片，加入100ul激活缓冲液，振荡孵育5分钟两次；

3.2纯净水洗芯片两次以后加入结合缓冲液，振荡孵育5分钟两次；

3.3吸去芯片上残留液体；

3.4混合35ul内参照到酶切反应体系，振荡混匀，取60ul加到芯片上，振荡孵育30分钟；

3.5洗脱缓冲液洗脱3次，每次5分钟，最后用水洗两次；

3.6取出芯片，小心吸干残留溶液，每个芯片点加1ulSPA，风干以后再点一次；

3.7送入MALDI-TOF-MS仪器进行芯片读取；

3.8软件分析目的峰以及内参照峰面积，以目的峰除以内参照峰面积的值作为X轴，以标准血清浓度为Y轴做一次曲线，根据病人的峰面积计算其酶切活性；

3.9用过的金属螯合芯片用重生缓冲液处理30分钟，然后用纯净水反复冲洗，晾干以后备用。

3.一种采用根据权利要求1所述的底物的体外测定量测定ADAMTS-13酶活性的试剂盒，其特征在于：包括以下底物、内标物、稀释液、缓冲液、结合液、洗脱液、基质。

成分组成具体如下：

(1)、去离子水

(2)、反应缓冲液(5mM Tris-HCl，5mM NaCl，pH 7.5，containing 1mM BaCl2)

(3)、激活缓冲液(50mM nickel sulfate)

(4)、洗脱缓冲液(1XPBS，0.8M sodium chloride，with 0.1％Triton X-100)

(5)、平衡缓冲液(1mMHEPES，pH 7.0)

(6)、结合缓冲液(1XPBS)

(7)、基质(SPA：5mg/100μl ACN，100μl 1％ TFA)

(8)、底物

(9)、内标多肽

(10)、PNP正常混合血浆浓度曲线(S1-S7)。