[发明专利]一种基于温皿制备干细胞膜片的方法

说明书

本发明公开了一种基于温皿制备干细胞膜片的方法，其包括以下步骤：步骤1、对温皿进行预处理，步骤2、进行细胞接种、培养，步骤3、对培养后的细胞进行洗涤，步骤4、进行膜片获取，步骤5、将膜片移至普通培养皿中，步骤6、将收获后的膜片进行再培养。本发明依据不同种类细胞的形态和特点，确定了细胞膜片在不同规格温度敏感性培养皿中的接种数量、包被时间以及细胞代数和成膜的时间及膜片获取后再培养等技术手段。使膜片制备更加方便快捷并可得到更加完美的细胞膜片。从而解决了不同种类细胞膜片的制备和在收获膜片时的技术问题。

技术领域

本发明涉及生物医药技术、细胞组织工程领域，具体涉及干细胞培养过程中的不同组织类型来源的贴壁培养干细胞的膜片制备技术方法及其涵盖在缺血性疾病治疗中的组织修复及临床症状改善的应用。

背景技术

干细胞是一类具有多向分化潜能和自我复制能力的原始的未分化细胞，是形成哺乳类动物组各个织器官的原始细胞。在修复机体、器官移植、医学美容等众多领域都有极高的应用价值。干细胞研究已成为生命科学领域的重大热点。

干细胞按照分化潜能可分为三大类：

1、全能干细胞

2、多能干细胞--造血干细胞

3、单能干细胞

细胞膜片制备技术，是通过物理的方法将在特殊处理过的培养皿上扩增融合的细胞从培养皿底壁分离，获得完整膜片状细胞结构的一种技术。与传统胰酶消化收集细胞的方法相比，运用该技术收集到的细胞保留了体外培养过程中分泌的胞外基质、建立的细胞-基质连接以及细胞间连接等结构。细胞膜片技术无须支架材料和酶消化，通过刺激细胞外基质分泌形成致密细胞膜片组织，能100％将细胞保留在病灶组织部位，有效地修复组织缺损和改善器官功能。

细胞膜片可通过多种方法收获。日本学者Okano等提出利用温度敏感型培养皿获得细胞膜片。还有文献报道在培养的细胞中添加不同浓度的维生素C也可收获细胞膜片。温度敏感型培养皿主要由特殊的温度敏感材料聚N-异丙基丙烯酰胺(poly N-isopropylacrylamide，PIPAAm)经过特殊处理后结合在培养皿底面，由于其表面分子链上同时具有亲水性基团酰胺基(-CONH-)和疏水性的异丙基[-CH(CH3)2-]，所以；当温皿在37℃细胞培养时皿中的材料为疏水性，细胞处于正常贴壁状态，当温皿离开37℃培养温度至32℃时，温皿中的敏感材料变为亲水性，贴附于培养皿底部的细胞胞即可自动脱壁并依靠其自身分泌的细胞外基质extracellular matrix(ECM)而形成具有二维结构的完整膜性细胞片。

这种基于在温度敏感型培养皿内培养收获的细胞膜片，其优势为；避免了细胞收获时消化胰酶及分散酶对细胞进行消化时导致细胞膜蛋白的损伤，而细胞膜蛋白的变异会致使细胞发生功能障碍或功能缺失，这会减弱干细胞在治疗医学上的应用潜能。采用这种降温回收细胞的方式，可以使细胞与细胞外基质蛋白无损共同脱附，有效的保护了细胞膜蛋白和相关受体，从而保证了细胞的生理功能和细胞更强的功能特性。同时也为组织修复和再生医学领域开创了新的研究方向“细胞膜片工程”。

目前，组织工程技术主要是以“细胞+复合材料”的组合方式，而细胞的获得往往都是使用胰酶或其他酶类作为贴壁细胞的消化液而收获细胞，这种方法使得细胞与细胞间的信号分子和细胞连接受到破坏。会影响移植后细胞的存活及组织的再生效果，同时使用的生物材料载体在体内的植入和降解均会引起局部组织的免疫反应和毒性反应而影响组织的再生修复效果。细胞膜片技术就是以不需要材料支架、收获细胞膜片时不使用消化酶而让细胞膜片最大限度的保留了细胞外基质和细胞连接，可以更好的模拟细胞生长的微环境，细胞膜片直接贴敷于病灶部位，使细胞100％保留在病灶处发挥更大的功能。

有文献报道可以用50mg/m L--100mg/ml维生素C添加到培养基中，可以形成细胞膜片。(《山东医药》2016年35期人牙周膜干细胞膜片的制备)