[发明专利]一种用于检测棉花黄萎病病原大丽轮枝菌的RPA引物、探针、试剂盒和检测方法

说明书

本发明公开了一种用于检测棉花黄萎病病原大丽轮枝菌的RPA引物、探针、试剂盒和检测方法，属于生物安全技术领域。所述的RPA引物如下，RPA上游引物序列Vd‑RPA‑F如SEQ ID No.1所示，其下游引物序列Vd‑RPA‑R如SEQ ID No.2所示；所述的RPA探针根据所述的RPA引物扩增区域设计，其序列大小为49bp，其5’端用FAM标记，3’端用C3‑Sp acer修饰，且在RPA探针的序列中间距5’端33bp处进行THF修饰。本发明还提供基于所述RPA引物和探针形成的试剂盒和检测方法。本发明首次将RPA技术应用到棉花黄萎病病原大丽轮枝菌的分子检测，其兼具特异性强、灵敏度高、实用性好、对仪器设备要求较低的特点，为棉花黄萎病的早期诊断、病害防治和农药减量使用提供新方法。

技术领域

本发明属于生物安全技术领域，具体地说，涉及一种用于检测棉花黄萎病病原大丽轮枝菌的RPA引物、探针、试剂盒和检测方法。

背景技术

由大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)引起的棉花黄萎病属于土传性真菌病害，在世界各棉区普遍发生，是制约棉花生产最主要的病害之一。大丽轮枝菌主要以微菌核的形式在土壤中长期存活，可以在棉花的各生育时期入侵并发病。我国是棉花黄萎病发生危害最严重的地区，且发病程度呈明显上升趋势。因此，快速准确地检测出大丽轮枝菌，对棉花黄萎病的早期诊断、监测和预警以及综合防治具有及其重要的意义。

近年来，分子生物学技术的不断发展，为大丽轮枝菌的快速检测提供了良好的技术平台。目前，常规分子检测技术主要包括聚合酶链式反应(PCR)、巢式PCR技术、微流控芯片PC R、限制性片段长度多态性(RFLP)、实时荧光定量PCR(qPCR)、环介导等温技术(LAMP)等。上述检测方法具有特异性强、灵敏度高及准确性高等优点，同时可以实现对发病组织和大批量土壤样品的定量检测，但是该技术对仪器设备、实验条件、人员专业素质要求较高。因此，继续开发对大丽轮枝菌高效、精确、对仪器设备要求低的检测技术具有重要的实践价值。

重组酶聚合酶扩增技术(Recombinase polymerase amplification，RPA)是新兴的恒温扩增技术，其在重组酶的介导下模拟DNA复制过程。重组酶与RPA引物结合形成蛋白-DNA 复合物后，与模板DNA进行同源比对，在单链结合蛋白的作用下，模板DNA解链，引物与模板DNA结合。随后，在DNA聚合酶的作用下，进行扩增反应，整个过程在37℃-42℃恒温反应20min即可完成；同时结合侧向流动免疫层析技术，可在10min内完成RPA扩增产物的检测，即利用RPA技术可在30min内完成对大丽轮枝菌的可视化检测。目前，RPA技术已广泛应用于病毒、细菌、支原体和寄生虫的快速检测中，但尚未见其在棉花黄萎病病原大丽轮枝菌检测方面的报道。

发明内容

1、要解决的问题

针对棉花黄萎病病原大丽轮枝菌尚无有效进行RPA技术检测的问题，本发明提供一种用于检测棉花黄萎病病原大丽轮枝菌的RPA引物、探针、试剂盒和检测方法，它可以提高棉花黄萎病病原大丽轮枝菌检测的特异性和灵敏度，为棉花黄萎病病原大丽轮枝菌的现场检测和早期诊断提供新方法。

2、技术方案

为解决上述问题，本发明采用如下的技术方案。

一种用于检测棉花黄萎病病原大丽轮枝菌的RPA引物和RPA探针，

所述的RPA引物基于棉花黄萎病病原大丽轮枝菌的ITS区差异序列设计，

所述的RPA引物的上游引物Vd-PRA-F如SEQ ID No.1所示，

所述的RPA引物的下游引物Vd-PRA-R如SEQ ID No.2所示；

所述的RPA探针根据所述的RPA引物扩增区域设计，