[发明专利]一种用于检测棉花黄萎病病原大丽轮枝菌的RPA引物、探针、试剂盒和检测方法

权利要求书

1.一种用于检测棉花黄萎病病原大丽轮枝菌的组合物，所述组合物为RPA引物和RPA探针，其特征在于：

所述的RPA引物基于棉花黄萎病病原大丽轮枝菌的ITS区差异序列设计，

所述的RPA引物的上游引物Vd-PRA-F如SEQ ID No.1所示，

所述的RPA引物的下游引物Vd-PRA-R如SEQ ID No.2所示；

所述的RPA探针根据所述的RPA引物扩增区域设计，

所述的RPA探针的序列大小为45bp-54bp，其5’端用FAM标记，3’端用C3-Spacer修饰，且在RPA探针的序列中间距5’端的30bp-38bp处进行THF修饰；

所述的RPA引物的下游引物包括如SEQ ID No.2所示的序列，且其5’端用Biotin修饰；

所述的RPA探针Vd-LF-Probe如SEQ ID No.3所示的序列，其序列大小为49bp，其5’端用FAM标记，3’端用C3-Spacer修饰，且在RPA探针的序列中间距5’端的33bp处进行THF修饰。

2.一种含有权利要求1所述的组合物用于检测棉花黄萎病病原大丽轮枝菌的试剂盒。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：所述的试剂盒还包括RPA反应管、阴性对照模板、阳性对照模板中的至少一种。

4.一种用于检测棉花黄萎病病原大丽轮枝菌的检测方法，其特征在于：

包括以下步骤：

（1）提取样品中的DNA；

（2）以步骤（1）提取的DNA作为待检测DNA模板，采用权利要求1或2所述的RPA引物和RPA探针，在RPA反应管中进行RPA扩增反应；

（3）分析RPA扩增产物。

5.根据权利要求4所述的用于检测棉花黄萎病病原大丽轮枝菌的检测方法，其特征在于：步骤（1）中所述的样品为棉田发病土壤。

6.根据权利要求4所述的用于检测棉花黄萎病病原大丽轮枝菌的检测方法，其特征在于：所述的RPA引物和RPA探针的检出下限为10 pg DNA 。

7.根据权利要求6所述的用于检测棉花黄萎病病原大丽轮枝菌的检测方法，其特征在于：步骤（2）中RPA扩增反应的反应体系以50μL计为：

待检测DNA模板 1.0μL

10μmol/L 权利要求1所述的RPA引物的上游引物 2.1μL

10μmol/L 权利要求1或2所述的RPA引物的下游引物 2.1μL

10μmol/L 权利要求1或2所述的RPA探针 0.6μL

反应缓冲液 29.5μL

RPA冻干粉 5.0mg

280mmol/L醋酸镁 2.5μL

ddH₂O 补足至50μL。

8.根据权利要求4所述的用于检测棉花黄萎病病原大丽轮枝菌的检测方法，其特征在于：步骤（2）中RPA扩增反应的反应条件为：37℃-45℃下反应20分钟，随后冰上终止反应。

9.根据权利要求4-8任意一项所述的用于检测棉花黄萎病病原大丽轮枝菌的检测方法，其特征在于：步骤（3）中分析RPA扩增产物的方法包括如下步骤：取RPA扩增产物与缓冲液混匀制备混合液，将试纸条上样区置于混合液中，4min-5min后观察并记录结果；结果的判定如下：若试纸条的检测线位置出现条带，而且质控线位置出现条带，则表明该样品中含有棉花黄萎病病原大丽轮枝菌，若试纸条的仅质控线位置出现条带，则表明该样品中不含有棉花黄萎病病原大丽轮枝菌。