[发明专利]一种应用于雨生红球藻高效扩繁的连续梯度补料方法及装置

说明书

本发明公开了一种应用于雨生红球藻高效扩繁的连续梯度补料方法及装置，步骤是：不同梯度补料培养基的配制；雨生红球藻活化扩种；雨生红球藻接种至发酵罐：检测扩种后的藻液细胞数，以新鲜灭菌的培养基洗净后重悬，接入发酵罐；监测培养参数/pH控制；定向调节培养基碳氮比。装置由发酵罐、出/进气口、出/进样口、补料口、pH/温度/溶氧控制单元、连续梯度补料单元组成，该方法避免了转换培养过程中的染菌，提高了对底物的利用效率，且生产的细胞用于后续虾青素诱导，存活率高，该阶段的生物量及虾青素产率分别高达0.30 g Lsupgt;‑1/supgt; dsupgt;‑1/supgt;和15.45 mg Lsupgt;‑1/supgt; dsupgt;‑1/supgt;。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，更具体涉及一种应用于雨生红球藻高效扩繁的连续梯度补料方法，同时还涉及一种连续梯度补料的装置，尤其适合于雨生红球藻大规模培养中种源高效扩繁的阶段。

背景技术

雨生红球藻(Haematococcus pluvialis)是一种淡水单细胞的绿藻，具有双鞭毛，隶属于绿藻门，团藻目，红球藻科。在胁迫条件，如强光照、氮缺乏等条件下细胞内能积累类胡萝卜素，其中约85％以上为虾青素和虾青素酯。

虾青素，是一类维生素A源的酮式次生类胡萝卜素，化学名为3,3’-二羟基-4,4’-二酮基-β,β’-胡萝卜素。值得注意的是，虾青素分子中含有长的多共轭不饱和双键，这种结构极易与自由基反应并对其进行清除，因此具有强大的抗氧化性能。天然虾青素在医药、营养品、保健品、化妆品等领域有所应用，特别在鱼类养殖行业中被用作饲料添加剂和着色剂，能改善鱼类体色并提高了使用价值，同时也增加了鱼体的抗病能力。

目前已有的雨生红球藻的规模化培养通常采用两步法，第一步实现雨生红球藻营养细胞的分裂和繁殖；第二步雨生红球藻在胁迫条件下积累虾青素。虾青素产率在实际生产中是雨生红球藻规模化培养中最为关键的评价指标，该指标由细胞密度、虾青素含量、细胞在光合诱导过程的存活率三个方面决定，其中围绕着细胞密度和虾青素含量两个方面已有许多文献及专利的报道，而嫌少关注细胞在光合诱导过程的存活率，该存活率与细胞的形态有很大关系，处于孢子阶段的细胞，存活率最高。

第一步的目的是获得高密度的细胞。许多文献专注如何获得高密度的雨生红球藻细胞，却忽视了细胞的状态，绿色阶段的细胞(游动细胞、不动胶囊细胞)在第二阶段会出现漂白死亡等现象，导致细胞在该阶段的生物量和虾青素产率低下。因此，在第一阶段中，细胞产率和细胞状态需要同时考虑。在第一阶段细胞培养中，已有的文献报道中存在3种培养模式，一为光合自养模式，也就是利用光能进行光合作用，国际上已成功实现规模化生产的模式主要是基于光合自养的两阶段模式，传统的两阶段光自养存在诸如扩种难、产量低、占地大、受季节变化影响大、效率低等问题。此外，也有鲜少报道雨生红球藻异养发酵培养，通过异养发酵的生物量可以达到27g/L。但是，从表1可见，由于异养发酵过程中细胞在长时间黑暗的条件下，所获得的细胞的光合活性很低，其最大光合效率F_v/F_m低于0.6，造成了异养生长获得的细胞在第二阶段高光照、缺氮等胁迫条件，大部分细胞的色素体会被漂白，造成异养生长的细胞在第二阶段生物量和虾青素产率低下(表1-BP_s和AP_s)。因此，在细胞培养的阶段，有必要探索一种新型的雨生红球藻高密度且全孢子化的种源培养模式，将为后续的光合诱导产虾青素阶段提供高密度高品质的种源，将能大幅度降低其规模化培养的成本，从而实现国内外雨生红球藻生产的更新迭代。除了光合自养和异养发酵，雨生红球藻还存在一种兼性培养模式，该模式既能利用有机碳进行异养生长获得高密度的细胞，同时，此阶段的雨生红球藻可以积累有效的虾青素，并伴随着细胞孢子化(不动胶壳细胞、不动孢子等)且能维持较高的光合活性，有利于下一步的虾青素诱导合成阶段。