[发明专利]一种基于I-B-Svi型CRISPR-Cas系统中SviCas5-6-7的转录调控方法

说明书

本发明公开了一种基于1类I型CRISPR‑Cas系统的转录调控方法。首次利用靶向g‑DNA转录后生成的crRNA引导I‑B‑Svi型CRISPR‑Cas系统中SviCas5，SviCas6与SviCas7形成的Cascade与靶标DNA形成的三位一体的R‑loop复合物，实现了对细胞基因组进行准确、快速、有效的基因转录调控。本转录调控工具的开发对基于2类CRISPR‑Cas系统的转录调控提出了挑战与补充。

本发明涉及生物技术领域的基因工程技术，确切地说是一种基于I-B-Svi型CRISPR-Cas系统中SviCas5，SviCas6与SviCas7的转录调控方法。

背景技术

基因调控指生物体内基因表达的控制机制，主要包括(1)DNA半保留复制合成新DNA水平上的调控(合成调控)、(2)DNA转录成信使核糖核酸mRNA水平上的调控(转录调控)和(3)mRNA翻译成蛋白质水平上的调控(翻译调控)(真核中常涉及蛋白质翻译后的修饰)。生物通过基因调控改变代谢方式以适应环境的变化，是分子遗传学和发生遗传学的重要研究领域。本发明主要关注的是应用I型CRISPR-Cas系统对生物细胞进行mRNA水平上的转录调控。

I型CRISPR-Cas系统的转录调控原理是：靶向g-DNA生成的crRNA引导Cascade与靶标DNA形成三位一体的R-loop复合物，在缺失核酸内切酶Cas3的情况下，特异性干扰转录延伸，RNA聚合酶结合，或转录因子结合[Yibei Xiao，Min Luo，Adam E.Dolan，Maofu Liao，Ailong Ke.(2018)Structure basis for RNA-guided DNA degradation by Cascade andCas3.Science(New York，N.Y.)361，doi：10.1126/science.aat0839；Yibei Xiao，MinLuo，RobertP.Hayes，Jonathan Kim，Sherwin Ng，Fang Ding，Maofu Liao，and Ailong Ke(2017)Structure Basis for Directional R-loop Formation and Substrate HandoverMechanisms in Type I CRISPR-Cas System.Cell 170，48-60 ell，doi：10.1016/j.cell.2017.06.012]。已发现的CRISPR-Cas系统被分为两类六型，其中1类I型CRISPR-Cas系统最为广泛。迄今为止，应用CRISPR-Cas系统进行基因调控报道最多是2类II型CRISPR-Cas系统中的dCas9[Matthew H Larson，Luke A Gilbert，Xiaowo Wang，Wendell A Lim，Jonathan S Weissman&Lei S Qi(2013)CRISPR interference(CRISPRi)for sequence-specific control of gene expression.Nat Protoc 8，2180-2196，doi：10.1038/nprot.2013.132]。此外，2类VI型Cas13a(从前的C2c2)也可用于专一性的mRNA敲除[OmarO.Abudayyeh，Jonathan S.Gootenberg，Silvana Konermann，Julia Joung，IanM.Slaymaker，David B.T.Cox，Sergey Shmakov，Kira S.Makarova，Ekaterina Semenova，Leonid Minakhin，Konstantin Severinov，Aviv Regev，Eric S.Lander，EugeneV.Koonin，and Feng Zhang(2016)C2c2 is a single-component programmable RNA-guided RNA-targeting CRISPR effector.Science(New York，N.Y.)353，aaf5573，doi：10.1126/science.aaf5573]。