[发明专利]一种基于I-B-Svi型CRISPR-Cas系统中SviCas5-6-7的转录调控方法在审
| 申请号： | 201910420999.8 | 申请日： | 2019-05-13 |
| 公开（公告）号： | CN110438142A | 公开（公告）日： | 2019-11-12 |
| 发明（设计）人： | 童望宇;刘青阳;种法根 | 申请（专利权）人： | 安徽大学 |
| 主分类号： | C12N15/70 | 分类号： | C12N15/70;C12N15/77;C12N15/81;C12N15/90;C12N9/22;C12R1/19;C12R1/15;C12R1/865 |
| 代理公司： | 暂无信息 | 代理人： | 暂无信息 |
| 地址： | 230601 安徽省*** | 国省代码： | 安徽;34 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 转录调控 基因转录调控 细胞基因组 靶标DNA 复合物 靶向 三位一体 补充 挑战 开发 | ||
1.一种基于I-B-Svi型CRISPR-Cas系统中SviCas5-6-7的转录调控方法，其特征在于：维吉尼亚链霉菌IBL14基因组中含有3个基因cas5，cas6与cas7分别编码蛋白质SviCas5，SviCas6和SviCas7(蛋白序列见附表)，该三个蛋白质在生物体中表达后结合靶向DNA(guide-DNA/g-DNA：由转录启动子/promoter、重复序列/repeat、间隔序列/spacer及转录终止子/terminator组成；其中间隔序列是与靶基因特定序列互补的DNA片段)或与靶基因具有互补序列的模板DNA(template DNA/t-DNA)可对生物体基因组中的基因转录进行有效调控。
2.根据权利要求1所述的一种基于I-B-Svi型CRISPR-Cas系统中SviCas5-6-7的转录调控方法，其特征在于：
(1)调控载体的构建
根据SviCas5，SviCas6和SviCas7氨基酸序列，合成相应细胞的碱基优化的DNA序列，并结合g-DNA和表达载体DNA序列设计引物，经表达载体构建(PCR扩增与连接酶分别将蛋白编码基因cas6-7-5和g-DNA与表达载体连接)得到表达蛋白的调控载体Vectori-cas6-7-5-g-DNA。
(2)基因转录调控转化子的获取与检验
通过转化、转染或电转化的方法，将按步骤(1)得到的蛋白表达调控载体Vectori-cas6-7-5-g-DNA导入生物细胞中，选择培养得到候选的基因转录调控转化子；对候选转化子进行功能鉴定、靶序列PCR及测序分析，得到正确的基因转录调控转化子。
3.根据权利要求1或2所述的一种基于I-B-Svi型CRISPR-Cas系统中SiCas5-6-7的转录调控方法，其特征在于：所述的SviCas5，SviCas6和SviCas7氨基酸序列指原始的或工程改造后的SviCas5，SviCas6和SviCas7氨基酸序列。
4.根据权利要求1或2所述的一种基于I-B-Svi型CRISPR-Cas系统中SviCas5-6-7的转录调控方法，其特征在于：所述的基因转录调控转化子指因基因转录水平的调控而导致靶蛋白表达水平的上调、下调或不表达，进而宿主细胞的表观、功能及生理发生变化的转化子。
5.根据权利要求1或2所述的一种基于I-B-Svi型CRISPR-Cas系统中SviCas5-6-7的转录调控方法，其特征在于：所述的相应的碱基优化的DNA序列指根据SviCas5，SviCas6和SviCas7氨基酸序列而优化的适合于在不同细胞中表达的cDNA序列。
6.根据权利要求1或2所述的一种基于I-B-Svi型CRISPR-Cas系统中SviCas5-6-7的转录调控方法，其特征在于：所述的生物体指原核及真核生物中的任何一种，如：大肠杆菌、谷氨酸棒状杆菌、酿酒酵母、小鼠胚胎成纤维细胞。
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