[发明专利]一种基于SviCas6-SviCas3的基因编辑方法

说明书

本发明公开了一种基于SviCas6‑SviCas3的基因编辑方法。应用SviCas6与SviCas3结合t‑DNA和g‑DNA，首次实现了SviCas6‑SviCas3对生物细胞基因组的基因编辑，也为基于CRISPR‑Cas系统进行的基因编辑提供了新的补充和多样性的选择。该系统可对原核和真核生物基因组中基因进行有效的、准确的、稳定的基因编辑，可望应用于许多与生物技术相关的领域中。

本发明涉及生物技术中的基因工程领域，确切地说是一种源于维吉尼亚链霉菌IBL14的I-B-Svi型CRISPR-Cas系统中SviCas6与SviCas3的基因编辑方法。

背景技术

本质上，基因编辑就是通过工程设计所需功能的模板DNA(template DNA/t-DNA)，通过导向专一性的限制性内切酶对基因组中的DNA进行切割，进而利用细胞自身的同源修复(homology directed repair/HDR)机制达到基因编辑的目的[Giedrius Gasiunas，Tomas Sinkunas，and Virginijus Siksnys(2014)Molecular mechanisms of CRISPR-mediated microbial immunity.Cell Mol Life Sci 71，449-465，doi：10.1007/s00018-013-1438-6]。导向专一性的限制性内切酶的导向机制可分为三个水平：(1)蛋白质导向，如：锌指核酸内切酶(zinc-finger nucleases/ZFN)；(2)RNA导向，如CRISPR-Cas系统；和(3)DNA导向，如我们发现的SviCas3导向[童望宇，唐严严，夏婷婷(20170919)一种基于I-B型CRISPR-Cas系统基因cas3的基因编辑方法，申请号：201710847193.8.]。与蛋白质导向相比，RNA导向因其成本低、简便、快捷、高效已广泛应用于生物、医药、农业及食品等领域。

基于原核生物细胞免疫中Cas效应物的组成与结构，CRISPR-Cas系统现分为2类六型[Eugene V Koonin，Kira S Makarova and Feng Zhang(2017)Diversity，classification and evolution of CRISPR-Cas systems.Current opinion inmicrobiology 37，67-78，doi：10.1016/j.mib.2017.05.008]。而1类I型最为广泛，占已鉴定的细胞基因组的60％以上。众所周知，在1类I型CRISPR-Cas系统中，由Cse1，Cse2，Cas5，Cas6，Cas7等蛋白组成的Cascade是细胞免疫必需的功能复合体，其中Cas6执行crRNA与发夹结构的加工形成功能[Yibei Xiao，Min Luo，Adam E.Dolan，Maofu Liao，Ailong Ke(2018).Structure basis for RNA-guided DNA degradation by Cascade andCas3.Science(New York，N.Y.)361，doi：10.1126/science.aat0839；PrarthanaMohanraju，Kira S.Makarova，Bernd Zetsche，Feng Zhang，Eugene V.Koonin，John vander Oost(2016)Diverse evolutionary roots and mechanistic variations of theCRISPR-Cas systems.Science(New York，N.Y.)353，aad5147，doi：10.1126/science.aad5147]。