[发明专利]一种基于SviCas6-SviCas3的基因编辑方法

权利要求书

1.一种基于SviCas6-SviCas3的基因编辑方法，其特征在于：维吉尼亚链霉菌IBL14基因组中含有一个I-B-Svi型CRISPR-Cas系统，该系统中的蛋白质SviCas6和SviCas3(氨基酸序列见附表)结合模板t-DNA(template DNA)和靶向g-DNA(guide-DNA)可对生物细胞基因组中的基因进行有效编辑。

2.根据权利要求1所述的一种基于SviCas6-SviCas3的基因编辑方法，其特征在于，包括编辑工具的构建及重组子的构建与检验步骤如下：

(1)编辑载体的构建

根据SviCas6和SviCas3氨基酸序列，合成相应生物细胞的碱基优化的DNA序列，并结合t-DNA、g-DNA及表达载体DNA序列设计引物，经引物合成、PCR扩增、限制性酶切割及连接酶连接，分别将蛋白编码基因、t-DNA、g-DNA和表达载体连接得到蛋白SviCas6-SviCas3表达的基因编辑工具Vector-cas6-3-t/g-DNA。

(2)重组子的构建与检验

制备生物细胞感受态，将按步骤(1)得到的编辑工具Vector-cas6-3-t/g-DNA通过转化或转染的方法导入生物细胞中，选择培养得到潜在的基因编辑重组子；对潜在重组子进行功能鉴定、靶序列PCR扩增及测序分析，得到正确的基因编辑重组子。

3.根据权利要求1或2所述的一种基于SviCas6-SviCas3的基因编辑方法，其特征在于：所述的SviCas6和SviCas3指原始的或氨基酸序列突变后的SviCas6和SviCas3。

4.根据权利要求1或2所述的一种基于SviCas6-SviCas3的基因编辑方法，其特征在于：所述的t-DNA指合成的按所需遗传功能设计的具有与靶序列两端互补的DNA片段，可与编辑工具分离而独立存在。

5.根据权利要求1或2所述的一种基于SviCas6-SviCas3的基因编辑方法，其特征在于：所述的g-DNA指合成的可转录得到crRNA/CRISPR-RNA的DNA片段(由转录启动子/promoter、重复序列/repeat、间隔序列/spacer及转录终止子/terminator组成)。

6.根据权利要求1或2所述的一种基于SviCas6-SviCas3的基因编辑方法，其特征在于：所述的相应生物细胞的碱基优化的DNA序列指根据SviCas6和SviCas3氨基酸序列而优化的适合在不同生物细胞中蛋白表达的碱基优化的cDNA序列。

7.根据权利要求1或2所述的一种基于SviCas6-SviCas3的基因编辑方法，其特征在于：所述的基因编辑重组子指因基因组中的DNA被专一性的敲除、插入、无痕点突变及任意组合的编辑后而导致宿主细胞的表型、功能及生理发生变化的遗传稳定的重组子。

8.根据权利要求1或2所述的一种基于SviCas6-SviCas3的基因编辑方法，其特征在于：所述的生物细胞指原核生物细胞和真核生物细胞的任何一种，如：大肠杆菌、谷氨酸棒杆菌、酿酒酵母、人胚肾细胞等。