[发明专利]一种基于流式细胞术检测NK细胞杀伤活性的方法

说明书

一种基于流式细胞术检测NK细胞杀伤活性的方法，包括以下步骤：步骤1，接种并培养细胞；步骤2，收集细胞并染色：采用CD2‑APC荧光染料对NK细胞和肿瘤细胞进行分群，随后采用Annexin V‑FITC/SYTOX Green对凋亡和坏死的靶细胞进行染色；步骤3，流式上机检测。本发明使用Annexin V‑FITC/SYTOX Green双染，采用相同检测通道将凋亡细胞和坏死细胞全部标记出来，显著降低了对NK杀伤后肿瘤细胞各种不同状态(早期凋亡、中晚期凋亡或坏死细胞)的漏检。

技术领域

本发明属于细胞杀伤活性检测技术领域，特别涉及一种基于流式细胞术检测NK细胞杀伤活性的方法。

背景技术

自然杀伤细胞(Natural killer cell，NK cell)是机体天然免疫系统的重要组成部分。在多种细胞因子(如IL-2、IL-15等)、饲养细胞(Feeder cells)的作用下，NK细胞可发生增殖和活化，随后释放穿孔素及颗粒酶杀死肿瘤细胞、病毒和清除非己细胞。NK细胞与肿瘤免疫、抗病毒免疫、移植免疫及自身免疫疾病密切相关。例如在多数肿瘤(特别是中晚期及伴有转移的肿瘤)、免疫缺陷等患者中，NK细胞活性降低；而在某些病毒感染性疾病早期、长期使用干扰素及其诱导物、宿主抗移植物反应等患者中，NK细胞活性增高。因此，准确评价外周血或体外培养NK细胞的杀伤活性，是了解NK细胞功能及评估过继性免疫治疗效果的一种重要手段。

目前检测NK细胞杀伤活性的方法较多，可分为同位素标记法、酶反应比色法和流式细胞术三大类。同位素标记51Cr释放法被认为是“金标准”，该方法准确性较高，但因设备昂贵且存在放射污染，现已不常使用。酶反应比色法有乳酸脱氢酶(LDH)释放法和四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法，两者易受外界因素(温度、pH值、试剂)影响，以及细胞自发释放底物等因素，造成准确性及重复性较差。流式细胞术(Flow Cytometry，FCM)是一种在液流系统中快速测定单个细胞或细胞器的生物学性质，并把特定的细胞或细胞器从群体中加以分类收集的技术。鉴于其在单细胞水平上高效准确的定量分析优势，目前涌现出多种以流式细胞术为基础的NK细胞杀伤活性的测定方法，但各自仍然存在缺陷。以下对现有流式细胞术检测方法的不足进行分类说明。

首先，由于效应细胞(NK细胞)和靶细胞(肿瘤细胞)在共培养过程中，靶细胞对效应细胞可能会产生一定抑制和破坏作用，则共培养体系的死亡率可能是包括靶细胞和效应细胞的共同死亡率。为更加准确地反映NK细胞的杀伤功能，现有流式细胞术检测方法多采用以下方案区分靶细胞和效应细胞，然后分析靶细胞的死亡率：(1)如果效应细胞和靶细胞的体积相差比较大，可通过FSC/SSC设门的方式将两种细胞区分开。(2)如果效应细胞和靶细胞的体积相同或相差不大，通过设门难以分开，则需标记细胞进行区分。多使用荧光染料标记靶细胞，如钙荧光素乙酰氧基甲酯(CAM)、羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(CFSE)、VybrantDiO(DiO)和MitoTracker Green(MTG)。但是这种标记方法存在荧光染料自发释放后被邻近效应细胞吸收，且荧光染料对细胞功能造成潜在影响，持续时间短，稳定性差等问题。

其次，经效应细胞(NK细胞)杀伤作用后，靶细胞将处于各种不同状态(活细胞、早期凋亡细胞、晚期凋亡及坏死细胞)。目前流式细胞术检测方法主要采用7-氨基放线菌素(7-AAD)、碘化丙啶(PI)、SYTOX Green单染法来鉴定靶细胞的死亡率。三者均为核酸染料，可与凋亡细胞浆内的DNA结合。虽然它们能够特异性地检测靶细胞的凋亡率，但仅能标记晚期凋亡及坏死细胞，漏检早期凋亡细胞，从而无法全面反映NK细胞的杀伤活性。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于流式细胞术检测NK细胞杀伤活性的方法，以解决上述问题。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种基于流式细胞术检测NK细胞杀伤活性的方法，包括以下步骤：

步骤1，接种并培养细胞；