[发明专利]一种基于流式细胞术检测NK细胞杀伤活性的方法

权利要求书

1.一种基于流式细胞术检测NK细胞杀伤活性的方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1，按比例混合效应细胞即NK细胞为KHYG-1细胞和靶细胞即肿瘤细胞为K562细胞，培养后收集细胞，无需提前标记效应细胞即NK细胞和靶细胞即肿瘤细胞，接种并培养细胞；

步骤2，收集细胞并染色：采用CD2-APC荧光染料对NK细胞和肿瘤细胞进行分群，随后采用Annexin V-FITC/SYTOX Green对凋亡和坏死的靶细胞进行染色；

步骤3，流式上机检测；

步骤1具体包括：接种效应细胞即NK细胞为KHYG-1细胞、靶细胞即肿瘤细胞为K562细胞，并培养，实验前1-2天给细胞换液，调整细胞至对数生长期的最佳状态；KHYG-1细胞培养于含IL-2的细胞培养基中；

具体包括：

1)NK细胞为效应细胞，肿瘤细胞为靶细胞，1500rpm离心NK细胞和肿瘤细胞5分钟，重悬并分别计数，调整细胞密度为0.5х10⁶/ml；

2)接种细胞至24孔板；设置不同效应细胞与靶细胞比例，E:T ratio；取1ml K562细胞加入对照孔，取1ml KHYG-1细胞和1ml K562细胞混合后加入实验孔；

3)继续培养4小时；

步骤2包括以下步骤：

1)收集2孔细胞至流式管，于1500rpm离心细胞5分钟，弃掉上清，用4℃的PBS缓冲液洗涤1-2次；

2)每管加入4℃的100μl FACS staining buffer，再加入5μl CD2-APC荧光染料，冰浴避光静置30分钟；

3)用4℃的PBS缓冲剂离心洗涤细胞1-2次后，每管加入4℃的100μl Annexin V-FITCbinding buffer，再加入5μl Annexin V-FITC荧光染料和1μl SYTOX Green荧光染料，冰浴避光静置15分钟；

4)流式上机检测前，每管补加300μl Annexin V-FITC binding buffer；

步骤3包括以下步骤：

1)在FSC/SSC散点图中，设门圈定包括效应细胞和靶细胞的全部细胞；

2)在APC/SSC散点图中，将Step 1圈定的细胞分为APC⁺和APC^-细胞，APC⁺为表达CD2的KHYG-1NK细胞，APC-为CD2表达阴性的K562肿瘤靶细胞；

3)在FITC/Count直方图中，分析Step 2中APC-细胞的FITC通道荧光强度，计算出早期凋亡、中晚期凋亡和坏死的K562细胞总比例。

2.根据权利要求1所述的一种基于流式细胞术检测NK细胞杀伤活性的方法，其特征在于，PBS缓冲液含0.5％BSA和0.1％叠氮化钠；SYTOX Green荧光染料的浓度为1mg/ml。