[发明专利]高卢蜜环菌的PCR-RFLP鉴别方法

说明书

本发明公开了高卢蜜环菌的PCR‑RFLP鉴别方法。本发明提供了用于鉴定或辅助鉴定待测蜜环菌为A型蜜环菌还是B型蜜环菌的引物对，是通过包括如下步骤的方法设计得到的：将SEQ ID No.5与SEQ ID No.6进行序列比对，得到DNA比对序列矩阵；然后根据所述DNA比对序列矩阵中第550位核苷酸之前的保守区域设计上游引物，根据所述DNA比对序列矩阵中第555位核苷酸之后的保守区域设计下游引物；所述上游引物和所述下游引物组成所述引物对。本发明方法可以有效鉴别A型蜜环菌和B型蜜环菌。本发明为市售菌株鉴别提供一种快速、客观的检测方法，为栽培生产中高卢蜜环菌的高效利用奠定基础。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及高卢蜜环菌的PCR-RFLP鉴别方法。

背景技术

蜜环菌是担子菌门、蜜环菌属的兼性寄生性真菌，广泛分布于世界各地。在中药材天麻和猪苓的生长过程中，蜜环菌为他们提供营养，因此蜜环菌菌种的优劣直接影响天麻和猪苓产量。蜜环菌中含有丰富的糖苷水解酶，能将植物的多糖水解成单糖供其自身生长使用。因此，水解多糖的能力是影响蜜环菌营养获取和生长发育的关键因素。目前市售蜜环菌菌种主要为高卢蜜环菌，但不同地区高卢蜜环菌的基因型存在差异，也可能导致其水解多糖能力存在差异。因此，在栽培过程中，常出现因蜜环菌菌种差异导致天麻、猪苓的产量和品质存在差异。

市售高卢蜜环菌资源繁多，但其在外形上很难进行分辨。DNA分子标记技术在中药的真伪鉴别与质量评价等相关研究已成功运用多年。聚合酶链反应-限制性内切酶酶切长度多态性(Polymerase Chain Reaction-Restriction Fragment Length Polymorphism，PCR-RFLP)技术是一种快速便捷分析物种组成的方法，已广泛应用于动植物中药的真伪鉴别。

发明内容

本发明利用高卢蜜环菌蔗糖酶基因序列设计PCR-RFLP鉴别方法，旨在为市售菌株鉴别提供一种快速、客观的检测方法，为栽培生产中高卢蜜环菌的高效利用奠定基础。

第一方面，本发明要求保护一种用于鉴定或辅助鉴定待测高卢蜜环菌为高卢蜜环菌A型还是高卢蜜环菌B型的引物对。

本发明所要求保护的用于鉴定或辅助鉴定待测高卢蜜环菌为高卢蜜环菌A型还是高卢蜜环菌B型的引物对，具体可通过包括如下步骤的方法设计得到：将SEQ ID No.5与SEQID No.6进行序列比对，得到DNA比对序列矩阵(如图1所示)；然后根据所述DNA比对序列矩阵中第550位核苷酸之前的保守区域设计上游引物，根据所述DNA比对序列矩阵中第555位核苷酸之后的保守区域设计下游引物；所述上游引物和所述下游引物组成所述引物对。

所述DNA比对序列矩阵具体可为采用序列比对软件(如DNAMAN等)将SEQ ID No.5与SEQ ID No.6进行比对，软件直接输出的比对结果图谱(图谱上所标注的位置信息即为在DNA比对序列矩阵中的位置)。

进一步地，所述引物对可为如下(a)或(b)：

(a)由SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的两条单链DNA组成的引物对；

(b)由将SEQ ID No.1和SEQ ID No.2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加后所得序列所示的两条单链DNA分子组成的，且与(a)中所述引物对功能相同的引物对。

第二方面，本发明要求保护用于鉴定或辅助鉴定待测高卢蜜环菌为高卢蜜环菌A型还是高卢蜜环菌B型的试剂盒。

本发明所要求保护的用于鉴定或辅助鉴定待测高卢蜜环菌为高卢蜜环菌A型还是高卢蜜环菌B型的试剂盒，含有前文第一方面所述的引物对和限制性内切酶EcoR V或其同裂酶。

根据需要，所述试剂盒中还可含有用于PCR扩增和/或酶切的常规反应试剂。