[发明专利]高卢蜜环菌的PCR-RFLP鉴别方法

权利要求书

1.用于鉴定或辅助鉴定待测高卢蜜环菌为高卢蜜环菌A型还是高卢蜜环菌B型的试剂盒，含有引物对和限制性内切酶EcoR V或其同裂酶；

所述引物对为由SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的两条单链DNA组成的引物对；

所述高卢蜜环菌A型为-80℃冷冻干燥48h时葡萄糖含量大于120 µg/g菌株干重的高卢蜜环菌菌种；所述高卢蜜环菌B型为-80℃冷冻干燥48h时葡萄糖含量小于等于120 µg/g菌株干重的高卢蜜环菌菌种。

2.权利要求1所述的试剂盒在鉴定或辅助鉴定待测高卢蜜环菌为所述高卢蜜环菌A型还是所述高卢蜜环菌B型中的应用。

3.引物对在鉴定或辅助鉴定待测高卢蜜环菌为高卢蜜环菌A型还是高卢蜜环菌B型中的应用；

所述引物对为由SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的两条单链DNA组成的引物对；

所述高卢蜜环菌A型为-80℃冷冻干燥48h时葡萄糖含量大于120 µg/g菌株干重的高卢蜜环菌菌种；所述高卢蜜环菌B型为-80℃冷冻干燥48h时葡萄糖含量小于等于120 µg/g菌株干重的高卢蜜环菌菌种。

4.一种鉴定或辅助鉴定待测高卢蜜环菌为高卢蜜环菌A型还是高卢蜜环菌B型的方法，包括如下步骤：

（A1）从待测高卢蜜环菌中提取基因组DNA作为模板，采用由SEQ ID No.1和SEQ IDNo.2所示的两条单链DNA组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR产物；

（A2）按照如下方法确定所述待测高卢蜜环菌为高卢蜜环菌A型还是高卢蜜环菌B型：若所述PCR产物的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，则所述待测高卢蜜环菌为或候选为高卢蜜环菌A型；若所述PCR产物的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，则所述待测高卢蜜环菌为或候选为高卢蜜环菌B型；

所述高卢蜜环菌A型为-80℃冷冻干燥48h时葡萄糖含量大于120 µg/g菌株干重的高卢蜜环菌菌种；所述高卢蜜环菌B型为-80℃冷冻干燥48h时葡萄糖含量小于等于120 µg/g菌株干重的高卢蜜环菌菌种。

5.一种鉴定或辅助鉴定待测高卢蜜环菌为高卢蜜环菌A型还是高卢蜜环菌B型的方法，包括如下步骤：

（B1）从待测高卢蜜环菌中提取基因组DNA作为模板，采用由SEQ ID No.1和SEQ IDNo.2所示的两条单链DNA组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR产物；

（B2）采用限制性内切酶EcoR V对步骤（B1）所得PCR产物进行完全酶切；

（B3）按照如下方法确定所述待测高卢蜜环菌为高卢蜜环菌A型还是高卢蜜环菌B型：若经步骤（B2）酶切获得的DNA片段为如下（a1），则所述待测高卢蜜环菌为或候选为高卢蜜环菌A型；若经步骤（B2）酶切获得的DNA片段为如下（a2），则所述待测高卢蜜环菌为或候选为高卢蜜环菌B型：

（a1）大小为304bp的一个DNA片段；

（a2）大小分别为304bp、183bp和121bp的三个DNA片段；

所述高卢蜜环菌A型为-80℃冷冻干燥48h时葡萄糖含量大于120 µg/g菌株干重的高卢蜜环菌菌种；所述高卢蜜环菌B型为-80℃冷冻干燥48h时葡萄糖含量小于等于120 µg/g菌株干重的高卢蜜环菌菌种。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：在所述（a1）中，大小为304bp的DNA片段的核苷酸序列为SEQ ID No.3；

在所述（a2）中，大小为304bp的DNA片段的核苷酸序列为SEQ ID No.4，且SEQ ID No.4的第120位为A，第185位为C，第235位为C；大小为183bp的DNA片段的核苷酸序列为SEQ IDNo.4的第1-183位，且第120位为C；大小为121bp的DNA片段的核苷酸序列为SEQ ID No.4的第184-304位，且对应SEQ ID No.4的第185位为T，对应SEQ ID No.4的第235位为T。

7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于：进行所述PCR扩增时，采用的退火温度为52-58℃。