[发明专利]一种基于转录组测序开发山茶属植物SSR引物的方法

说明书

本发明提供一种基于转录组测序开发山茶属植物引物的方法：以茶树叶片为材料进行cDNA库的构建和illumina测序，经过滤和从头组装后获得转录组数据。使用MISA、SSR Hunter完成位点搜索，并对包含SSR位点的序列进行生物信息学分析。以此为据进行SSR分子标记引物的开发，利用开发的引物对部分山茶属植物材料进行遗传多样性分析。本发明成功设计38对引物，经多态性筛选最终获得16对多态性引物，利用这16对引物检测了部分山茶属植物资源的遗传相似性，验证了这些引物的可用性。本发明为山茶属植物SSR引物开发提供了新思路。

技术领域

本发明属于分子生物学标记技术领域，具体涉及基于转录组序列开发的山茶属SSR标记引物对及其应用。

背景技术

茶树(Camellia sinensis)是山茶科山茶属植物，起源于中国西南地区。栽培历史悠久，关于茶树栽培的论述性文字记载可追溯至唐(杨逢春等，海南师范大学学报(自然科学版)，2006，19(3)：277-282.)。在人工选择和异花授粉的交叉作用下，山茶属植物形成了极为丰富的种质资源。分子生物学的发展为山茶属植物遗传变异的研究工作提供了更好的选择。90年代初期便有关于分子标记在山茶属植物中应用的相关报道，而SSR分子标记在山茶属植物领域开发和应用则仅有十几年的时间(胡慈杰，中国科学技术协会学会学术部，2014：5)。

转录组是一定条件下包括信使RNA、核糖体RNA、转运RNA及非编码RNA在内的所有转录物的集合。转录组能有效反馈植物基因的表达、调节等信息，反映基因组的表达与不同外界环境的关联性。任意生命体的任意部位或组织均可进行转录组测序。转录组测序技术兼具检测范围广、灵敏度高等优点，测序技术的进步为基于转录组SSR标记的开发提供了更加丰富的资源(王楚彪等，桉树科技，2018，35(04)：20-26.)。

SSR标记是分子标记的重要手段之一，是一种以1～6个核苷酸为基元多次串联后形成的核苷酸序列。由于同一物种不同基因型的SSR位点在重复基元的组成、重复频率存在较大的差异，在染色体上的分布也存在差异，等位基因的多样性也由此形成(敖日格乐，贾晓，葛台明.湖北民族学院学报(自然科学版)，2009，27(04)：462-467.)。SSR的分布涵盖了原核和真核生物基因组且可以鉴别纯合子和杂合子，因此SSR遗传标记被广泛应用于植物遗传变异的相关研究。

本发明通过对茶树转录组测序发掘到一批Unigene，从中搜索到大量位点涵盖一至六核苷酸元件，设计并合成引物38对，经多态性筛选最终获得16对多态性引物，利用这16对引物检测了部分山茶属植物资源的遗传相似性，验证了这些引物的可用性。

发明内容

针对现有技术的不足，发明提供一种基于转录组测序开发山茶属植物SSR引物的方法，包括：

S1：构建茶树转录组文库并测序，将测序结果进行滤和从头组装后获得转录组数据，即Unigene库；

S2：对步骤S1中的Unigene库进行SSR位点检测；

S3：根据SSR位点信息进行引物设计，并鉴定引物的多态性。

设计的引物共38对，引物序列如SEQ ID NO.1-76所示。

综上所述，本发明由于采用了上述方案，具有以下积极效果：

本发明利用转录组数据开发的SSR标记引物，信息更全面、通用性好、效率更高，可以挖掘到更多的位点。

本发明采用生物信息学途径进行山茶属植物SSR标记引物的开发，可大批量开发SSR标记引物，获得了一批扩增效率高且多态性好的SSR标记引物对，克服了传统方式开发标记步骤繁琐、工作量大、成本高的问题。

附图说明

图1.茶树转录组各类型SSR的比例

图2.茶树转录组重复次数分布