[发明专利]一种获得高纯度重组人血清白蛋白的纯化方法

说明书

本发明涉及一种获得高纯度重组人血清白蛋白的纯化方法，该方法包括将发酵液进行离心和加热处理后依次进行初级超滤、二级超滤，随后使用30％的酒精和6mol/L的尿素将包裹在重组人血清白蛋白份子中的杂质去除，再进行蛋白复性、洗脱、透析，得到去杂液，最后将所得去杂液依次进行阳离子交换层析、阴离子交换层析、疏水层析，得到所述高纯度重组人血清白蛋白。通过此方法获得的重组人血清白蛋白具有纯度高、杂质少、不易降解、稳定性高等优势，具有良好的应用前景。最终获得基因重组人血清白蛋白的纯度达到了医药级(纯度大于99.999999％)的水平，完全符合美国药典和日本药典对注射剂级基因重组人血清白蛋白的要求。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种获得高纯度重组人血清白蛋白的纯化方法。

背景技术

目前，随着经济条件的发展，人们对医疗健康的关注度越来越高。人血清白蛋白(HSA)在近几十年的临床治疗中发挥了各种各样的作用。血液制品白蛋白的用量也是供不应求，由于血液制品的安全性的提高，白蛋白由血液制得的产量十分有限，运用生物基因技术生产一种血液替代品变为热点。

经过数年，科研人员成功的使用多种表达系统实现了重组人血清白蛋白(rHSA)的表达。但是其中发酵液中杂质较多，主要成份为杂蛋白、核酸、脂肪酸、色素、多糖、热原物质及各种各样的蛋白酶等。重组白蛋白的分离与血浆蛋白质相比，存在一些挑战：目标产物在表达系统中的产量低；产物数量级是克或者毫克；会产生附加产物蛋白酶，蛋白酶可能会使目标蛋白分解；发酵液成分构成复杂，包含有重组人血白蛋白、酵母菌的菌体、色素、盐类离子、细胞排泄物等；在发酵液过程中会伴有内毒素产生，但是人血浆内没有内霉素。因此纯化对质量要求十分严格，因此从发酵液中分离、纯化目标产物是重组人血清白蛋白产业化的重要环节。

发明内容

为了解决现有技术存在的上述问题，本发明提供了一种获得高纯度重组人血清白蛋白的纯化方法，通过此方法获得的重组人血清白蛋白具有纯度高、杂质少、不易降解、稳定性高等优势。

本发明所采用的技术方案为：

(1)将含有重组人血清白蛋白的发酵液进行离心处理，目的除去发酵液中的菌体等杂质，随后加入热稳定剂进行加热，目的灭活蛋白酶，得到重组人血清白蛋白上清液；

(2)对重组人血清白蛋白上清液依次进行初级超滤、二级超滤，对上清液中的重组人血清白蛋白进行粗提，得到重组人血清白蛋白超滤液；

(3)将重组人血清白蛋白超滤液加入到预先平衡好的Ni-NTA层析柱中，依次使用去杂蛋白溶液、去杂液、平衡液对Ni-NTA层析柱进行冲洗，随后使用蛋白洗脱液进行洗脱，使用透析液对洗脱下的蛋白进行透析，得到重组人血清白蛋白透析液；使用去杂液能够使重组人血清白蛋白的结构被部分变性而其二硫键不被破坏，从而使吸附及包裹在其内部的色素等杂质暴露，进而与重组人血清白蛋白分离；

(4)对所述重组人血清白蛋白透析液依次进行阳离子交换层析、阴离子交换层析、疏水层析，得到所述高纯度重组人血清白蛋白。

进一步的，步骤(1)中，将所述含有重组人血清白蛋白的发酵液在转速4000-8000r/min离心处理15-35min。

进一步的，步骤(1)中，所述热稳定剂为辛酸钠和乙酰色氨酸钠的混合物，质量比为(2-4):1；所述加热温度为66-70℃，所述加热时间为20-40min。

进一步的，步骤(2)中，所述初级超滤采用的为分子质量为80kD的超滤膜，所述初级超滤的pH值为6.8-7.2，所述初级超滤的操作压力为0.14-0.16MPa。

进一步的，步骤(2)中，所述二级超滤采用的超滤膜的分子质量为10kD、30kD或50kD中的任一种，所述二级超滤的pH值为6.8-7.2，所述二级超滤的操作压力为0.14-0.16MPa。