[发明专利]一种获得高纯度重组人血清白蛋白的纯化方法

权利要求书

1.一种获得高纯度重组人血清白蛋白的纯化方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)将含有重组人血清白蛋白的发酵液进行离心处理，随后加入热稳定剂进行加热，得到重组人血清白蛋白上清液；

(2)对重组人血清白蛋白上清液依次进行初级超滤、二级超滤，得到重组人血清白蛋白超滤液；

(3)将重组人血清白蛋白超滤液加入到预先平衡好的Ni-NTA层析柱中，依次使用去杂蛋白溶液、去杂液、平衡液对Ni-NTA层析柱进行冲洗，随后使用蛋白洗脱液进行洗脱，使用透析液对洗脱下的蛋白进行透析，得到重组人血清白蛋白透析液；

(4)对所述重组人血清白蛋白透析液依次进行阳离子交换层析、阴离子交换层析、疏水层析，得到所述高纯度重组人血清白蛋白。

2.根据权利要求1所述的一种获得高纯度重组人血清白蛋白的纯化方法，其特征在于，步骤(1)中，将所述含有重组人血清白蛋白的发酵液在转速4000-8000r/min离心处理15-35min。

3.根据权利要求1所述的一种获得高纯度重组人血清白蛋白的纯化方法，其特征在于，步骤(1)中，所述热稳定剂为辛酸钠和乙酰色氨酸钠的混合物，质量比为(2-4):1；所述加热温度为66-70℃，所述加热时间为20-40min。

4.根据权利要求1所述的一种获得高纯度重组人血清白蛋白的纯化方法，其特征在于，步骤(2)中，所述初级超滤采用的为分子质量为80kD的超滤膜，所述初级超滤的pH值为6.8-7.2，所述初级超滤的操作压力为0.14-0.16MPa。

5.根据权利要求1所述的一种获得高纯度重组人血清白蛋白的纯化方法，其特征在于，步骤(2)中，所述二级超滤采用的超滤膜的分子质量为10kD、30kD或50kD中的任一种，所述二级超滤的pH值为6.8-7.2，所述二级超滤的操作压力为0.14-0.16MPa。

6.根据权利要求1所述的一种获得高纯度重组人血清白蛋白的纯化方法，其特征在于，步骤(3)中，所述去杂蛋白溶液组成为20mmol/L的Tris-HCl、300mmol/L的NaCl和5mmol/L咪唑，所用体积为柱体积的2-4倍；

所述去杂液的组成为20mmol/L的Tris-HCl、20-40％的酒精和4-8mol/L的尿素，所述体积为柱体积的8-12倍。

7.根据权利要求1所述的一种获得高纯度重组人血清白蛋白的纯化方法，其特征在于，步骤(3)中，所述平衡液的组成为20mmol/L的Tris-HCl和300mmol/L的NaCl，所用体积为柱体积的5-9倍；

所述蛋白洗脱液的组成为20mmol/L的Tris-HCl、300mmol/L的NaCl和300mmol/L咪唑，所用体积为柱体积的5-10倍。

8.根据权利要求1所述的一种获得高纯度重组人血清白蛋白的纯化方法，其特征在于，步骤(3)中，所述透析液的组成为20mmol/L的Tris-HCl和50mmol/L的NaCl，所述透析温度为2-6℃，所述透析次数为1-3次，每次透析时间为1-3h，每次使用的透析液的体积为柱体积的80-120倍。

9.根据权利要求1所述的一种获得高纯度重组人血清白蛋白的纯化方法，其特征在于，步骤(4)中，所述阳离子交换层析的阳离子/疏水复合填料为Bestarose Diamond MMC；阴离子交换层析的阴离子交换介质具有DEAE基团；所述疏水层析的填料为Phenyl SepharoseHP或Phenyl Bestarose FF中的任一种。

10.根据权利要求1所述的一种获得高纯度重组人血清白蛋白的纯化方法，其特征在于，所制备的重组人血清白蛋白分子量为66.5kDa，等电点4.6-5.0，纯度大于99.999999％，多糖残留低于5ng/ml，内毒素含量小于0.2EU/ml。