[发明专利]角膜缘干细胞及其制备方法

说明书

本发明涉及一种高活性角膜缘干细胞及其制备方法，其制备方法包含以下步骤：获取角膜组织，将待用角膜组织预处理；向预处理后的角膜组织中加入含有细胞诱导剂的细胞冻存液；冷冻加有细胞冻存液的角膜组织；所述的细胞诱导剂是可诱导角膜组织中的细胞局部发生炎症或应激反应，但不直接引起细胞死亡的试剂。该方法在细胞培养前通过简单的低温冷冻操作即可在角膜组织中实现角膜缘干细胞与成熟分化的各类角膜细胞的筛选，同时可实现高活性角膜缘干细胞的长期冷冻保存，该方法无需特定的仪器设备，操作简便，筛选效率高，筛选细胞纯度高，可提高角膜缘干细胞的比例和活性。

技术领域

本发明涉及组织工程领域，特别是涉及一种角膜缘干细胞的制备方法。

背景技术

角膜缘是角膜和巩膜的移行区，由于透明的角膜嵌入不透明的巩膜内，并逐渐过渡到巩膜，在眼球表面和组织学上没有一条明确的分界线。角膜缘是天然储藏负责角膜上皮再生修复的成体干细胞位置，角膜缘干细胞在角膜缘组织中成栅栏状排列在上皮层基底部，是用于眼表角膜上皮溃疡及组织工程板层角膜重建的优质细胞来源，角膜缘干细胞移植被认为是目前针对眼表疾病最有前景的治疗方法之一。

角膜缘干细胞在角膜眼表重建中起重要作用，但由于角膜缘干细胞在体外培养时易分化，难以大量扩增，为此需要使用更温和的手段获取原代角膜缘干细胞，并寻找更佳的方法维持细胞在体外的干细胞活性。为了从角膜组织中获得角膜缘干细胞，现有的角膜缘干细胞的取材方法主要有：酶消化法和组织块贴壁法等。酶消化法的做法主要是利用胰蛋白酶、胶原酶或中性蛋白酶等在33℃下处理消化角膜组织，将角膜上皮层消化下来后接种于培养皿上培养；组织块贴壁法的步骤为剪取一定大小的角膜缘组织块贴在培养皿皿底，加入培养液使其迁出细胞进而培养。酶消化法虽然能获得较多细胞，但是角膜缘干细胞的纯度较低；组织块贴壁法获得的细胞较纯，但是组织块贴壁时间和细胞迁出时间较长。

虽然上述方法都能分离得到角膜缘干细胞，但是在后续体外培养中仍存在角膜缘干细胞活性较低、易分化等问题。为了维持角膜缘干细胞的干性，常使用细胞共培养、载体培养和培养基添加生长因子等的方法体外扩增细胞。细胞共培养方法是将角膜缘干细胞直接培养在饲养层细胞上，饲养层细胞分泌的生长因子和细胞因子能保持角膜缘干细胞的干性，但使用细胞饲养层容易导致细胞交叉污染，后续细胞分离难度较大。羊膜是角膜缘干细胞培养的良好载体，许多研究表明在羊膜上培养的角膜缘干细胞干性保持良好，存活率高，生长迅速，但是从羊膜上分离的角膜缘干细胞也存在细胞交叉污染的问题。在培养基中添加细胞生长因子也能促进角膜缘干细胞的生长，如表皮生长因子、肝细胞生长因子、碱性纤维母细胞生长因子和角质细胞生长因子等都能促进细胞有丝分裂、细胞移行和干细胞的增殖，但是目前添加生长因子的种类和比例未有确定说法。

尽管在培养中使用了多种方法维持角膜缘干细胞的活性，但是不可避免地仍有部分细胞发生了分化，为了在实际应用中如角膜缘干细胞移植手术、组织工程板层角膜构建、角膜病机制研究等获得更佳的效果，需要对角膜缘干细胞进行筛选获得其中高活性的干细胞，目前的筛选方法有:流式分选法、免疫磁珠法和胶原吸附分选法等。流式分选法是通过流式细胞仪对标记的细胞进行筛选的方法，免疫磁珠筛选是根据免疫学原理，利用包被有抗体的磁珠与干细胞表面的特殊标志特异性结合，再通过一定强度的磁场，将细胞滞留而分选的方法，流式分选法和免疫磁珠法是常用的细胞筛选方法，它们的优点是得到的细胞纯度高，其缺点是细胞被标定且和介质结合，需要从介质上洗脱下来，容易丢失一部分角膜缘干细胞，这两种方法还需要特定的仪器设备和抗体试剂，成本较高。胶原吸附分选法是根据上皮干细胞具有对细胞外基质快速吸附的能力，通过细胞对细胞外基质如胶原等的吸附时长，筛选出干细胞活性较高的角膜缘干细胞的方法，该方法分选速度快，避免了因时间长或者特殊物质的毒性而影响细胞活性，然而该法是一种比较粗略的筛选方法，无法准确筛选到角膜缘干细胞。