[发明专利]角膜缘干细胞及其制备方法

权利要求书

1.一种角膜缘干细胞的制备方法，其特征在于，包含以下步骤：

获取角膜组织，将待用角膜组织预处理；

向预处理后的角膜组织中加入含有细胞诱导剂的细胞冻存液；

冷冻加有细胞冻存液的角膜组织；

所述的细胞诱导剂是可诱导角膜组织中的细胞局部发生炎症或应激反应，但不直接引起细胞死亡的试剂；

所述细胞冻存液为含有所述细胞诱导剂的细胞培养液和冷冻保护剂的混合液；

所述细胞诱导剂为醋酸泼尼松龙和星状孢菌素，所述醋酸泼尼松龙在所述细胞培养液中的浓度为4μg/ml，所述星状孢菌素在所述细胞培养液中的浓度为20ng/ml；或者，所述细胞诱导剂为醋酸泼尼松龙和肿瘤坏死因子α，所述醋酸泼尼松龙在所述细胞培养液中的浓度为4μg/ml，所述肿瘤坏死因子α在所述细胞培养液中的浓度为10ng/ml；

所述冷冻采用液氮冰冻；

所述冷冻的时间为3个月或者6个月。

2.根据权利要求1所述的角膜缘干细胞的制备方法，其特征在于，所述冷冻保护剂和含有所述细胞诱导剂的细胞培养液的体积比为1：2～20。

3.根据权利要求2所述的角膜缘干细胞的制备方法，其特征在于，所述冷冻保护剂和含有所述细胞诱导剂的细胞培养液的体积比为1：2～10。

4.根据权利要求1所述的角膜缘干细胞的制备方法，其特征在于，所述冷冻保护剂选自二甲基亚砜、甘油、乙二醇、丙二醇、乙酰胺、甲醇、聚乙烯吡咯烷酮、果糖、蔗糖、葡聚糖、白蛋白、聚乙二醇、乙基淀粉和卵黄中的一种或多种。

5.根据权利要求1所述的角膜缘干细胞的制备方法，其特征在于，所述预处理包括：使用包含或不包含抗生素的生理缓冲液对待用角膜组织进行常规清洗、消毒、分离；及/或，

所述角膜组织选自人、啮齿类动物和其他哺乳动物的角膜组织中的任意一种或多种，所述角膜组织是新鲜角膜组织或者经过短期保存的角膜组织中的任何一种，其中所述短期保存的时间为1天～20天。

6.根据权利要求5所述的角膜缘干细胞的制备方法，其特征在于，所述分离培养的方法选自组织贴壁法和消化法中的一种或多种。

7.根据权利要求6所述的角膜缘干细胞的制备方法，其特征在于，所述组织贴壁法包括如下步骤：从角膜组织中将角膜缘组织分离后，将角膜缘组织上皮层帖附在培养容器中培养，使角膜缘干细胞从角膜缘组织中迁出，获得角膜缘干细胞。

8.根据权利要求6所述的角膜缘干细胞的制备方法，其特征在于，所述消化法包括如下步骤：利用消化酶将包含角膜缘干细胞的角膜上皮层从角膜组织中消化分离，然后将角膜上皮层接种于培养容器中培养，获得角膜缘干细胞。

9.根据权利要求1所述的角膜缘干细胞的制备方法，其特征在于，还包含以下步骤：分离培养冷冻后的角膜组织，即得所述角膜缘干细胞。

10.根据权利要求9所述的角膜缘干细胞的制备方法，其特征在于，用于所述培养的细胞培养液中添加有1ng/ml～100μg/ml所述细胞诱导剂。