[发明专利]在PDCD1基因表达的剪接水平抑制PD-1信号的反义寡核苷酸及其筛选方法与应用

权利要求书

1.在PDCD1基因表达的剪接水平抑制PD-1信号的反义寡核苷酸在制备治疗抗癌药物中的应用，所述反义寡核苷酸在PDCD1基因表达的mRNA前体剪接水平抑制PD-1信号； 所述反义寡核苷酸为促进外显子3跳跃而抑制 PD-1 信号的反义寡核苷酸；所述反义寡核苷酸的作用靶点存在于所述PDCD1基因的外显子3中，且该作用靶点为PDCD1外显子3上从第12位核苷酸至第45位核苷酸的一段序列，其序列为SEQ ID NO.1所示。

2.如权利要求1中所述的在PDCD1基因表达的剪接水平抑制PD-1信号的反义寡核苷酸的作用靶点的筛选方法，其特征在于：包括如下步骤：

S1、构建PDCD1小基因；

S2、寻找确认S1中PDCD1小基因中的两个外显子剪接增强子；

S3、初步筛选反义寡核苷酸；

S4、在初步筛选的反义寡核苷酸的基础上进行优化；

其中，所述S3和S4的初步筛选、优化均采用步移法进行。

3.如权利要求2所述的在PDCD1基因表达的剪接水平抑制PD-1信号的反义寡核苷酸的作用靶点的筛选方法，其特征在于：所述S1中包括如下步骤，

S11、设计引物，将人基因组DNA中PDCD1基因片段克隆到质粒pCI-neo构建PDCD1小基因，并通过测序验证其序列的正确性；所述PDCD1小基因序列为SEQ ID NO.2所示；

S12、将表达PDCD1小基因的质粒用支链聚乙烯亚胺（branched polyethylenimine）试剂转入各种细胞检测其剪接模式，发现外显子3的列入和跳跃是PDCD1小基因的主要可变剪接模式。

4.如权利要求2所述的在PDCD1基因表达的剪接水平抑制PD-1信号的反义寡核苷酸的作用靶点的筛选方法，其特征在于：所述S2包括如下步骤，

S21、对S1中PDCD1小基因中156nt的外显子3做序列删除分析，每个突变体删除12nt，构建13个突变体，由于第一个和最后一个突变体删除了部分3′和5′剪接位点序列，为避免剪接位点受损造成的影响，在13个突变体的基础上，补充两个不影响剪接位点的删除突变体；

S22、将构建的野生型PDCD1小基因和突变体共16个质粒用支链聚乙烯亚胺法转入A375细胞进行RNA剪接分析，跟野生型相比，其中两个不涉及剪接位点删除的突变体强烈抑制PDCD1外显子3列入，从而确认这两个突变体所删除的序列包含剪接增强子，分别为D13-24删除位点的增强子，和D133-144删除位点的增强子。

5.如权利要求2所述的在PDCD1基因表达的剪接水平抑制PD-1信号的反义寡核苷酸的作用靶点的筛选方法，其特征在于：所述S3包括如下步骤，

S31、首先设计16个15nt长的反义寡核苷酸，靶点覆盖一段长165nt的序列：内含子2最后5nt、整个156nt 外显子3和内含子3的前4nt；每个ASO与前一个ASO存在5nt 的重叠；每个ASO分别与PDCD1小基因共转染到A375细胞，观察ASO对外显子3剪接的影响；从细胞收集的RNA样品用荧光RT-PCR方法分析全长mRNA和缺乏外显子3 mRNA丰度的变化，计算外显子3的列入百分比，结果显示作用靶点为外显子3从16位到40位的一段序列的两条ASO能显著抑制外显子3的列入，且两条所述的ASO作用于D13-24删除位点的增强子及其下游序列，靶点序列含64%的C，提示C-丰富序列是剪接增强子的关键序列；

S32、进一步对S31中两个ASO进行剂量依赖性反应分析，对其抑制PDCD1外显子3剪接的抑制强度确认；

S33、选择两个ASO中效果较好的ASO，在人B淋巴细胞来源的RPMI 8226细胞检测并确认其对内源基因PDCD1剪接的影响。

6.如权利要求2所述的在PDCD1基因表达的剪接水平抑制PD-1信号的反义寡核苷酸的作用靶点的筛选方法，其特征在于：所述S4包括如下步骤，

S41、在作用位点覆盖外显子3序列从11位到45位中，设计共20个 20nt和18nt长的ASO，相邻ASO移动一个位置，以100 nM为终浓度，将每个ASO分别与PDCD1小基因共转染，观察ASO对外显子3剪接的影响，除了覆盖外显子3从11位到30位的序列没有效果，其他ASO都显著抑制外显子3的列入，因此确认12位至45位是ASO的有效作用区域，挑选出六个强烈抑制外显子3列入的ASO；

S42、进一步对以上S41挑选出的ASO进行了剂量依赖效应分析，并以不相关ASO为对照，再次确认六个ASO都能显著抑制外显子3的列入，其中覆盖外显子3从22位到41位的序列效果最好。