[发明专利]基于CRISPR-Cas去除宿主基因组DNA的宏基因组提取方法

说明书

本发明公开了一种基于CRISPR‑Cas系统组合物特异减少或去除宿主基因组DNA的宏基因组提取方法。本发明旨在提供一种在宏基因组测序中降低宿主基因组DNA背景、提高其余微生物有效测序数据的技术。所述方法中的CRSIPR‑Cas系统包括多个crRNA或crRNA/tracrRNA衍生物、以及带有生物素标记的核酸内切酶活力缺失的Cas蛋白或其变体蛋白。crRNA或crRNA/tracrRNA衍生物的序列与宿主基因组DNA中的重复序列Alu元件区域(靶序列)互补，借此引导核酸内切酶活力缺失的Cas蛋白或其变体结合在宿主基因组DNA上，再通过加入包被有链霉亲和素的磁珠捕获CRISPR‑Cas系统和其结合的宿主DNA，以此消减样品溶液中的宿主基因组DNA的浓度，并提高其他非宿主基因组DNA的核酸的丰度。

技术领域

本发明属于宏基因组检测领域，具体地涉及CRISPR技术和消减宏基因组核酸样品中宿主基因组DNA的方法。

背景技术

成簇的规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)/CRISPR相关蛋白(Cas)系统是细菌和古细菌在不断进化的过程中产生的适应性的免疫防御机制，用来保护自身的基因组免受外源核酸如噬菌体、病毒等的干扰和破坏。CRISPR/Cas系统作为一套适应性免疫系统，他应用CRISPR RNA(crRNA)以碱基互补的形式引导Cas蛋白识别入侵的外源基因组，并对其DNA进行剪切。根据Cas蛋白的序列和结构将CRISPR/Cas系统分为Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型。其中Ⅰ型和Ⅲ型系统都需要多个Cas蛋白原件，而Ⅱ型仅仅需要一个Cas蛋白作为效应蛋白。

这其中Cas9蛋白是II型CRISPR/Cas系统中一种最典型的蛋白，当与称为CRISPRRNA(crRNA)和反式激活crRNA(tracrRNA)的两个RNA组合复合物时，可以发挥核酸内切酶活性，从而切断入侵噬菌体或质粒中的外源DNA，以保护宿主细胞。crRNA从宿主基因组中的CRISPR元件转录而来，其中该CRISPR元件之前包含有捕获的外源DNA。另外，通过人工融合crRNA和tracrRNA中的必要部分核苷酸而产生的嵌合sgRNA(单链向导RNA)可以取代CRISPR-Cas系统组合物中的两个RNA成分，也能形成功能性地核酸内切酶。Cas9蛋白复合物能够识别的靶标DNA需要具备间隔序列邻近基序(Protospacer Adjacent Motif，PAM)。PAM的序列是较保守的，具体序列取决于Cas9的种类，如来源于化脓链球菌的SpCas9可以识别的PAM序列为5’-NGG-3’，其中N可以是A、G、C或T中的任意一种。

2015年新发现的Cas12a(之前被称为Cpf1)是另一种II型CRISPR/Cas系统中如今被广泛应用的蛋白。这一新发现的Cas12a系统有几个重要的特点不同于以往描述的Cas9：1)Cas12a系统更简单一些，它只需要一条较短的crRNA，不再需要tracrRNA；2)Cas12a酶也比标准SpCas9要小，使得它更易于传送至细胞和组织内；3)Cas12a以一种不同于Cas9的方式切割DNA。当Cas9复合物切割DNA时，它切割的是同一位点的两条链，留下的是平末端切口。采用Cas12a复合物生成的两条链切口是粘性末端，在裸露端留下了短垂悬；4)Cas12a复合物识别的靶标DNA位于PAM区下游，并且其切口远离识别位点。来源于毛螺科菌的LbCas12a和来源于嗜酸链球菌的AsCas12a是其中较典型的蛋白，其可以识别的PAM序列为5’-TTTV-3’，其中V可以是A、G或C中的任意一种。而来源于弗朗西丝氏菌属的FnCas12a可以识别更为宽松的PAM序列5’-TTN-3’。