[发明专利]基于CRISPR-Cas去除宿主基因组DNA的宏基因组提取方法

权利要求书

1.一种基于CRISPR-Cas去除宿主基因组DNA的宏基因组提取方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)从来源于宿主的样本中提取宏基因组总核酸，得到包含宿主基因组DNA的宏基因组核酸样品；

(2)将带有生物素标记的核酸内切酶活力缺失的Cas蛋白或其变体蛋白与多个聚簇规则间隔短回文重复RNA(crRNA)、反式激活crRNA(tracrRNA)或crRNA/tracrRNA衍生物在缓冲液中混合孵育，形成稳定的CRISPR-Cas系统组合物；

(3)将步骤(2)孵育好的CRISPR-Cas系统组合物与步骤(1)的包含宿主基因组DNA的宏基因组核酸样品混合，在缓冲液中反应；用包被有链霉亲和素的磁珠捕获CRISPR-Cas系统组合物和其结合的宿主基因组DNA，形成磁珠-蛋白-RNA-DNA复合物；用磁力架分离去除磁珠-蛋白-RNA-DNA复合物，达到消减样品溶液中的宿主基因组DNA浓度的目的。

2.根据权利要求1所述的宏基因组提取方法，其特征在于，所述CRISPR-Cas系统组合物包括：

(1)至少一种作用于双链DNA的II型(Class II)Cas蛋白或其衍生物，包括：第二亚型(Type II)的Cas9蛋白、第五亚型(Type V)的Cas12a或Cas12b蛋白；

(2)一条/组或多条/组靶向于宿主基因组DNA中重复序列Alu元件特定区域的单链RNA或双链RNA复合物，包括以下形式：

(a)至少一条单链crRNA，适用于Cas12a或其变体蛋白；或

(b)至少一组crRNA和tracrRNA组成的双链RNA复合物，适用于Cas9和Cas12b或其变体蛋白；或

(c)至少一条单链crRNA/tracrRNA衍生物，适用于Cas9和Cas12b或其变体蛋白。

3.根据权利要求1或2所述的宏基因组提取方法，其特征在于，所述crRNA、crRNA/tracrRNA衍生物包含与宿主基因组DNA中重复序列Alu元件特定区域的正义链或反义链靶DNA互补的特异性核苷酸序列。

4.根据权利要求1或2所述的宏基因组提取方法，其特征在于，所述tracrRNA部分序列能够与crRNA互补配对，与crRNA形成具有特定二级结构的双链RNA复合物，用于与Cas9和Cas12b蛋白或其变体蛋白形成稳定的CRISPR-Cas系统组合物。

5.根据权利要求1或2所述的宏基因组提取方法，其特征在于，所述crRNA/tracrRNA衍生物，是一条或多条融合有crRNA序列和tracrRNA序列的单链向导RNA(sgRNA)，其序列包含：

(1)至少一种向导序列，该向导序列能够与宿主基因组DNA中重复序列Alu元件特定区域的正义链或反义链靶DNA互补，和

(2)至少一种反式激活crRNA(tracrRNA)互补配对序列，和

(3)至少一种tracrRNA序列，

并且上述(1)、(2)和(3)按顺序以5’到3’方向排列时可以与Cas9蛋白形成稳定的CRISPR-Cas系统组合物；而当(3)、(2)和(1)按顺序以5’到3’方向排列时可以与Cas12b蛋白形成稳定的CRISPR-Cas系统组合物。

6.根据权利要求1或2所述的宏基因组提取方法，其特征在于，所述Cas9蛋白包含一种或多种天然的或工程化的Cas9酶，这些酶包括不同物种来源的Cas9以及这些蛋白的不同物种来源的野生型、改造过的、密码子优化过的、进化过的、嗜热的、嵌合的、工程化的和/或一种以上Cas蛋白的混合物；所述Cas9蛋白既可以利用crRNA和tracrRNA组成稳定的CRISPR-Cas系统组合物，也可以利用sgRNA组成稳定的CRISPR-Cas系统组合物。