[发明专利]一种调控神经干细胞中nestin基因表达的方法及靶向细胞的方法

说明书

本发明公开了一种调控神经干细胞中nestin基因表达的方法及靶向细胞的方法，涉及基因表达调控技术领域，包括依次进行的如下步骤，先在nestin基因的转录起始附近设计nestin基因的gRNA，再进行载体的构建，nestin基因的gRNA可以是引导转录抑制子的nestin‑i gRNA和引导转录激活子的nestin‑a gRNA中的任意一种。该方法简单，脱靶率低，且能在细胞株中稳定表达。克服了运用传统方法构建稳定细胞株的弊端，能够在短期获得稳定细胞株。

技术领域

本发明涉及基因表达调控技术领域，具体而言，涉及一种调控神经干细胞中nestin基因表达的方法及靶向细胞的方法。

背景技术

nestin基因的蛋白编码产物为NESTIN。NESTIN是第6类中间丝蛋白，也被称为巢蛋白，其分子量大小为220KDa-250KDa，其位于1号染色体中。nestin基因在结构上由3个内含子和4个外显子组成。NESTIN蛋白在结构上主要分为N端（1-7aa）、α螺旋区（8-313aa）以及C端（314-1621aa），其中α螺旋区又细分为4个部分，分别是1A，1B，2A和2B。

胚胎发育过程中nestin基因呈现广泛表达，其最早表达是在胚胎的单细胞神经外胚层上。此外，nestin还在多种细胞中表达，如新生血管内皮细胞、中肾间质细胞等，但在神经系统中nestin的表达是最丰富的。中枢神经系统发育在哺乳动物早期发育过程中是一个十分重要的事件，该过程表现为细胞的迁移以及细胞形态的变化，NESTIN作为一种中间丝蛋白，被作为神经干细胞的标记分子，对于神经干细胞的自我更新起着十分重要的作用。尽管Nestin在神经系统发育中起着重要的作用，但是其具体的影响以及作用机制尚不明确，因此阐明Nestin在神经系统发育中的分子机理显得十分必要。

对于基因的研究常见于在细胞中过表达或者沉默靶基因，观察靶基因在细胞命运改变中发挥的作用，而实现基因的过表达或者沉默主要有瞬时表达和稳定表达两类。其中，瞬时表达中外源DNA不会整合到基因组中，但是瞬时表达只能维持短短的几天时间；稳定表达中外源基因与基因组整合，能够在细胞中持续表达。传统的建立稳定细胞株通常通过瞬时转染的方式以及结合基因载体上的抗性基因进行筛选最终获得稳定细胞株，这样的方式存在工作时间长、效率低的问题，此外由于Nestin基因序列比较长，运用传统的方式建立稳定过表达细胞株比较困难，因此有必要建立一种新型的Nestin基因过表达或沉默的gRNA靶点序列。

CRISPR/Cas9是一种操纵基因组的技术，在引导RNA的指导下，Cas9能够靶向基因组中特定区域并对DNA进行切割，从而造成DNA双链断裂。CRISPR/Cas9常用于对基因组进行编辑。

鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种调控神经干细胞中nestin基因表达的方法，该方法简单，脱靶率低，且能在细胞株中稳定表达。克服了运用传统方法构建稳定细胞株的弊端，能够在短期获得稳定细胞株。这将更有利于研究Nestin基因在神经系统发育中的生物学功能及其具体的作用机制，对于我们认识神经干细胞的生命规律具有重要的指导意义。

本发明的另一目的在于提供一种靶向细胞的方法，该方法能够精确靶向细胞，对细胞进行转录前的基因调控。

本发明是这样实现的：

一种体外调控神经干细胞中nestin基因表达的方法，包括依次进行的如下步骤，先在nestin基因的转录起始附近设计nestin基因的gRNA，再进行载体的构建，nestin基因的gRNA可以是引导转录抑制子的nestin-i gRNA和引导转录激活子的nestin-a gRNA中的任意一种。