[发明专利]一种调控神经干细胞中nestin基因表达的方法及靶向细胞的方法

权利要求书

1.一种体外调控神经干细胞中nestin基因表达的方法，其特征在于，包括依次进行的如下步骤：先在nestin基因的转录起始附近设计nestin基因的gRNA，再进行载体的构建，所述nestin基因的gRNA为引导转录抑制子的nestin-i gRNA和引导转录激活子的nestin-agRNA中的任意一种；

所述nestin-i gRNA的序列如序列1-12所示，所述nestin-a gRNA的序列如序列13-24所示，所述nestin-i gRNA的序列如序列1-12所示的任意一种或多种的组合，所述nestin-agRNA的序列如序列13-24所示的任意一种或多种的组合。

2.根据权利要求1所述的体外调控神经干细胞中nestin基因表达的方法，其特征在于，所述nestin-i gRNA的靶定序列位于第一外显子转录起始位点下游1-112bp范围内，所述nestin-a gRNA的靶定序列位于第一外显子转录起始位点上游1-450bp范围内。

3.根据权利要求1所述的体外调控神经干细胞中nestin基因表达的方法，其特征在于，还包括使用293T细胞进行病毒包装，具体包括先对293T细胞进行均匀分散，将PEI混合液加入到质粒混合液中制得质粒-PEI混合液，再将质粒-PEI混合液加入含有239T细胞的培养基中共培养，浓缩收集病毒。

4.根据权利要求3所述的体外调控神经干细胞中nestin基因表达的方法，其特征在于，使用293T细胞进行病毒包装后进行细胞的感染和筛选，具体包括如下步骤：先准备病毒混合液，再往生长状态良好的神经干细胞中加入制备好的病毒液混合液，共培养。

5.根据权利要求4所述的体外调控神经干细胞中nestin基因表达的方法，其特征在于，细胞的感染后分别进行nes基因的表达水平检测和NESTIN蛋白水平的检测，其中，nes基因的表达水平检测所用的检测nes基因的引物如序列26-27所示。

6.根据权利要求1所述的体外调控神经干细胞中nestin基因表达的方法，其特征在于，所述方法包括过表达神经干细胞中nestin基因或沉默神经干细胞中nestin基因。

7.一种负载分子，其特征在于，包含有nestin基因的gRNA，所述nestin基因的gRNA的序列如序列1-24所示的任意一种或者多种的组合。

8.一种体外靶向细胞的方法，其特征在于，包括使细胞与负载分子接触，所述负载分子包含有nestin基因的gRNA，所述负载分子包含无催化活性结构域的dCas9，所述dCas9的序列如序列25所示，所述nestin基因的gRNA的序列如序列1-24所示，所述细胞是神经干细胞，新生血管内皮细胞和中肾间质细胞中的任意一种。

9.根据权利要求8所述的体外靶向细胞的方法，其特征在于，所述负载分子还包含有抗生素，所述抗生素是嘌呤霉素，潮霉素，罗红霉素，螺旋霉素，阿奇霉素，克拉霉素，万古霉素，链霉素，庆大霉素，四环素，多西环素，米诺环素，卡那霉素，氨苄青霉素和氯霉素中的任意一种或多种的组合。

10.根据权利要求9所述的体外靶向细胞的方法，其特征在于，所述抗生素为嘌呤霉素，潮霉素。