[发明专利]用于甾醇发酵生产胆酸的发酵菌的定向改进方法

说明书

本发明公开了一种能够提高发酵菌将甾醇转化为粗胆酸的转化率，并且工艺简单的用于甾醇发酵生产胆酸的发酵菌的定向改进方法。该发酵菌的定向改进方法包括以下步骤：S1、将甾醇连续倾倒在同一地点的土壤中，持续时间30d以上；S2、取甾醇倾倒出的土壤；提取菌悬液；将菌悬液滴入到培养基上培养获得菌落后，挑出单菌落；S3、将单菌落在培养基上培养，并且判断出是否为纯菌株；S4、将纯菌株分别接种到新的甾醇培养基上；判断纯菌株是否具有将甾醇发酵生产胆酸的能力；S5、纯菌株接种到新的甾醇培养基上；计算胆酸的转化率；S6、重复步骤S5，直到甾醇转化为胆酸的转化率大于或者等于90％。采用该发酵菌的定向改进方法工艺简单，获得的发酵菌转化率高。

技术领域

本发明涉及将甾醇发酵生产胆酸的领域，具体涉及一种用于甾醇发酵生产胆酸的发酵菌 的定向改进方法。

背景技术

熊去氧胆酸是治疗胆结石疾病的老药，随着熊去氧胆酸需求的增长，以及奥贝胆酸上市， 鹅去氧胆酸的需求越来越大，即将出现供不应求的局面，所以需要开发熊去氧胆酸的其它来 源。

鹅去氧胆酸是从鸡，鸭，猪胆里提取的天然物，主要用于熊去氧胆酸和奥贝胆酸的生产， 随着熊去氧胆酸需求的增长，以及奥贝胆酸上市，对鹅去氧胆酸的需求越来越大，即将出现 供不应求的局面，所以需要开发其它来源。

然而，甾醇可以通过在植物中进行提取，因此来源广泛，便于获得。并且熊去氧胆酸、 鹅去氧胆酸等胆酸可以通过甾醇生物发酵法进行制备。

由于现有的甾醇发酵生产胆酸的发酵菌将甾醇发酵生产胆酸率较低，因此需要对发酵菌 进行定向改进，从而提高发酵菌的转化率。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提出了一种能够提高发酵菌将甾醇转化为粗胆酸的转化率， 并且工艺简单的用于甾醇发酵生产胆酸的发酵菌的定向改进方法。

为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案来实现的：用于甾醇发酵生产胆酸的发 酵菌的定向改进方法，包括以下步骤：

S1、将甾醇连续倾倒在同一地点的土壤中，持续时间30d以上；

S2、取甾醇倾倒出的土壤；在采取的土壤试样中提取菌悬液；将菌悬液滴入到营养液为 甾醇的培养基上培养获得菌落后，挑出单菌落；

S3、将单菌落在营养液为甾醇的新的培养基上培养，并且判断出是否为纯菌株；将纯菌 株编号保存；

S4、将纯菌株分别接种到新的甾醇培养基上；同时判断纯菌株是否具有将甾醇发酵生产 胆酸的能力；如果有则将该纯菌株保留，如果没有则去除该纯菌株；

S5、将保留的纯菌株接种到新的甾醇培养基上；然后将菌落和培养基底分离，并且在培 养基底中提纯胆酸，并且计算胆酸的转化率；

S6、继续将分离出来的菌落接种到新的甾醇培养基上，重复步骤S5，直到甾醇转化为胆 酸的转化率大于或者等于90％。

进一步的，在步骤S2中，通过取甾醇倾倒出的土壤；置消毒试管中，加入无菌水以涡旋 振荡器振荡摇匀，静置后取上层清液，从而获得菌悬液。

具体的，在步骤S2中通过以下方法获得菌落，将菌悬液滴入到营养液为甾醇的培养基上， 并且放置到恒温培养箱中培养，等到长出菌落后，挑出单菌落。

具体的，在步骤S4中通过显色法判断纯菌株是否具有将甾醇发酵生产胆酸的能力；

将菌株接种在甾醇培养基中，待长出单菌落后，取菌落下面的培养基放置于试管中，加 冰醋酸溶液，超声处理，滤过，取滤液，置试管中，加新制的糠醒溶液与硫酸溶液，在70℃ 水浴中加热，溶液如呈蓝紫色，则此菌株具备转化能力:若不显蓝紫色，则不具备转化能力。