[发明专利]一种用于检测携带磺胺类耐药基因的嗜肺军团菌的多重PCR检测方法及应用

说明书

本发明涉及一种用于检测携带磺胺类耐药基因的嗜肺军团菌的多重PCR检测方法，所述方法在检测时使用如下两对特异性引物：F1：SEQ NO.1，即5’‑TCCGCCTGGACTAATCCTAAAG‑3’；R1：SEQ NO.2，即5’‑CACCAACCATCCCTATCTCATTAC‑3’；F2：SEQ NO.3，即5’‑CGTATTGCGCCGCTCTTAG‑3’；R2：SEQ NO.4，即5’‑ATCTAACCCTCGGTCTCTGGC‑3’。本发明所述的核酸序列，可用于临床快速检测诊断肺炎患者致病性细菌的磺胺类抗生素的耐药情况，为临床治疗提供参考依据。

技术领域

本发明属于微生物检测技术领域，涉及一种采用分子生物学手段检测微生物耐药基因的方法，尤其是一种用于检测携带磺胺类耐药基因的嗜肺军团菌的多重PCR检测方法及应用。

背景技术

军团菌病是与环境相关的急性呼吸道感染性疾病，与人类疾病关系最为密切的是嗜肺军团菌(Legionella pneumophila，Lp)。因此，嗜肺军团菌是引起军团菌肺炎的重要病原菌。由于军团菌是在细胞内寄生繁殖，因此，抗生素需到达肺泡细胞内才能更好地杀灭细菌。彻底治疗军团菌病，需选用脂溶性强的抗生素才有效。虽然治疗军团菌常用的抗生素为大环内酯类或者氟喹诺酮类抗生素，但强力霉素、利福平、磺胺类药及氟喹诺类药物亦可选用。

磺胺类药物是人工合成的抗菌药，用于临床已近50年，它具有抗菌谱较广、性质稳定、价格低、使用简便、生产时不耗用粮食等优点，因此被广泛使用。虽然大量的抗生素问世，但磺胺类药物仍是重要的化学治疗药物。随着磺胺类药物大范围的使用，临床各种细菌的分离株对其耐药率不断上升。各类细菌对磺胺类药物的耐药机制也存在明显的差异。(1)其中金黄色葡萄球菌的磺胺耐药机制为耐药株过量产生对氨苯甲酸(PABA)，对抗磺胺竞争。(2)肺炎链球菌的磺胺耐药机制为耐药株的二氢蝶酸合成酶编码基因突变。(3)革兰氏阴性菌的磺胺耐药机制与它们不同，其磺胺耐药机制分为两种，其一为细菌获得sul基因(编码二氢蝶酸合成酶)，使得细菌胞内二氢蝶酸合成酶增加，磺胺与PABA不构成竞争关系。其二为细菌获得dfr基因(编码二氢叶酸还原酶)，拮抗甲氧苄胺嘧啶，从而叶酸合成不受影响。因此革兰氏阴性菌表达sul基因和dfr基因，细菌中叶酸能正常合成从而细菌不受到磺胺类药物的影响。研究表明：sul基因和dfr基因均可由质粒、整合子、转座子等可移动遗传元件介导，因此极易在同种和不同种细菌中传播。

国内外已经从分子水平开展了对耐药基因的检测，目前对临床样本耐药基因型检测的方法有很多，其中DNA探针、聚合酶链反应(PCR)、荧光定量PCR等为基础的分子手段检测耐药基因取得了很大进展。在利用这些分子手段进行检测耐药基因时，所检测的基因往往是广泛存在的基因序列，而忽略了一些具有特异性基因序列的基因。

通过在NCBI的基因序列库中比对发现，磺胺类耐药基因sul1在革兰氏阴性菌如大肠杆菌、铜绿假单胞菌、沙门氏菌、克雷伯氏肺炎菌、阴沟肠杆菌、痢疾杆菌、弗氏柠檬酸杆菌、棒状杆菌属、嗜水气单胞菌、弗氏志贺菌等多种细菌中的保守序列同源性高达100％，而革兰氏阴性菌嗜肺军团菌中sul1基因的序列存在特异性，与其它革兰氏阴性菌的同源性仅为14.3％。因此在大多数检测磺胺类耐药基因sul1的方法中，都忽略了这个特异性序列。导致现有的对磺胺类耐药基因sul1的检测方法不能很好地涵盖所有的磺胺类耐药基因sul1。对于临床快速检测诊断肺炎患者致病性细菌的磺胺类抗生素的耐药情况不能进行全面检测。

通过检索，发现如下一篇与本发明专利申请相关的专利公开文献：

一种动物源细菌磺胺类药物耐药基因多重PCR检测技术(CN1944670)，该方法包括扩增待测细菌耐药基因的三对PCR引物以及PCR模板制备试剂和细菌耐药基因多重PCR扩增试剂，利用该多重PCR检测技术能扩增待测菌株磺胺类药的耐药基因。它具有灵敏度高、特异性高、应用范围广，结果准确可靠的特点。

通过对比，本发明专利申请与上述专利公开文献存在本质的不同。

发明内容