[发明专利]一种用于检测携带磺胺类耐药基因的嗜肺军团菌的多重PCR检测方法及应用

权利要求书

1.一种用于检测携带磺胺类耐药基因的嗜肺军团菌的多重PCR检测方法，其特征在于：所述方法在检测时使用如下两对特异性引物：

F1：SEQ NO.1；

R1：SEQ NO.2；

F2：SEQ NO.3；

R2：SEQ NO.4。

2.根据权利要求1所述的用于检测携带磺胺类耐药基因的嗜肺军团菌的多重PCR检测方法，其特征在于：所述方法在检测时，扩增后的目的片段长短大小各异，嗜肺军团菌sul1基因扩增后产物大小为1390bp，将这个基因命名为lp-sul1；除嗜肺军团菌之外的其他革兰氏阴性菌的磺胺类耐药基因sul1扩增后产物大小为643bp，将这个基因命名为nor-sul1，通过琼脂糖凝胶电泳直接进行分开辨别。

3.根据权利要求1所述的用于检测携带磺胺类耐药基因的嗜肺军团菌的多重PCR检测方法，其特征在于：所述除嗜肺军团菌之外的其他革兰氏阴性菌为大肠杆菌、铜绿假单胞菌、沙门氏菌、克雷伯氏肺炎菌、阴沟肠杆菌、痢疾杆菌、弗氏柠檬酸杆菌、棒状杆菌属、嗜水气单胞菌或弗氏志贺菌。

4.根据权利要求1至3任一项所述的用于检测携带磺胺类耐药基因的嗜肺军团菌的多重PCR检测方法，其特征在于：步骤如下：

⑴DNA模板的制备：分别在培养基中进行培养携带磺胺类耐药基因sul1的除嗜肺军团菌之外的其他革兰氏阴性菌和在活性炭酵母浸出物培养基中培养携带磺胺类耐药基因sul1的嗜肺军团菌，分别进行DNA的抽提，将提取的DNA在-20保存，并作为PCR的检测模板；

⑵多重PCR反应体系：以不大于50ng的质粒DNA或不大于200ng的基因组DNA为模板，使用两对引物F1和R1、F2和R2，其终浓度均为0.2μM，包含dNTPs和2mM Mg²⁺的2×PCRbuffer12.5μL，DNA聚合酶0.5μL，最终用ddH₂O补至25μL；

⑶多重PCR反应程序：预变性94℃2min；变性98℃10s，退火57℃30s，延伸68℃45s共30个循环；终延伸68℃2min；产物在4℃保存；

⑷取2-5μL多重PCR产物，与2μL 6×Loading buffer混匀，多重PCR产物经1.0％琼脂糖凝胶进行电泳检测；

根据凝胶成像系统呈现的电泳条带判断结果：如果只在1390bp处有特异性条带，说明该DNA样品中存在携带磺胺类耐药基因sul1的嗜肺军团菌；如果只在643bp处有特异性条带，说明该DNA样品中存在携带磺胺类耐药基因sul1的其他菌株；如果在643bp与1390bp处都有特异性条带，说明该细菌为携带磺胺类耐药基因sul1的嗜肺军团菌且同时存在携带磺胺类耐药基因sul1的其他菌株；无条带则为阴性，说明该菌既不是存在携带磺胺类耐药基因sul1的嗜肺军团菌，也不是存在携带磺胺类耐药基因sul1的其他菌株。

5.如1至4任一项所述的用于检测携带磺胺类耐药基因的嗜肺军团菌的多重PCR检测方法在快速检测诊断致病性细菌的磺胺类抗生素的耐药情况方面中的应用。