[发明专利]一种敲除spoⅡQ和pcf基因提高地衣芽孢杆菌发酵产酶的方法及应用

说明书

本发明涉及一种敲除spoⅡQ和pcf基因提高地衣芽孢杆菌发酵产酶的方法及应用，本发明通过敲除spoⅡQ、pcf基因，获得重组菌地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)DL‑1ΔspoⅡQΔpcf，芽孢形成率降低至0.16％，摇瓶发酵培养重组菌α‑淀粉酶酶活提高了10.9％，5L发酵培养时重组菌α‑淀粉酶酶活提高了19.3％。本发明在一定程度上提高了地衣芽孢杆菌目标酶的发酵活力，改善了菌株发酵生产性能，可以为工业微生物的基因工程育种提供思路和方法借鉴。

技术领域

本发明涉及一种敲除spoⅡQ和pcf基因提高地衣芽孢杆菌发酵产酶的方法及应用，属 于基因工程技术领域。

背景技术

芽孢杆菌是酶制剂行业重要的发酵生产菌株，其中地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis) 代谢旺盛，酶系丰富，能规模化发酵生产α-淀粉酶等，在纺织、食品、饲料、医药等行业有 广泛应用。

芽孢杆菌发酵产酶过程中，尤其在菌体生长到达稳定期后，由于营养条件及环境条件的 改变，菌体开始形成芽孢。芽孢的生成不利于高密度连续发酵，且会影响发酵过程控制，如 发酵液粘度增加、泡沫增多等，影响气质交换，容易造成逃液等，增加染菌机会，增加发酵 成本；此外，芽孢杆菌在生长过程中常伴有菌体自溶现象，不利于生物量的积累，缩短有效 的发酵周期，降低发酵生产效率。

中国专利文件CN108929883A(申请号201810886538.5)公开了芽孢形成相关基因spo ⅡE在影响菌株生长及产酶中的应用，该发明通过插入式失活的方式，将spoⅡE部分基因 片段与Cmr基因融合，融合基因spoⅡE-Cmr插入克劳氏芽孢杆菌spoⅡE基因序列中，使spoⅡE基因无法正常表达而失活，spoⅡE基因失活菌株不仅可以使芽孢生成率显著降低至0.3％，并且使工程菌株生长速度比原始菌株明显加快，实现了在更短时间内细胞数量的积累和更高活力的淀粉酶的发酵生产。

中国专利文件CN108949785A(申请号201810886539.X)公开了芽孢形成相关基因spo0A 在产酶方面的作用，通过插入式失活的方式，将spo0A部分基因片段与Cmr基因融合，融合 基因spo0A-Cmr插入克劳氏芽孢杆菌spo0A基因序列中，使spo0A基因无法正常表达而失活， 细胞代谢发生变化，在菌株芽孢生成率降低和蛋白酶削弱表达的同时，使淀粉酶酶活较之出 发菌株提高85.8％，果胶酶酶活提高235％，脂肪酶酶活提高70.0％。

上述技术方案均发现芽孢形成相关基因spo家族通过敲除后，可以提高淀粉酶的酶活， 因此，寻找更多的具有相关功能的基因，对于后续研究和制备淀粉酶具有非常显著的意义。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供一种敲除spoⅡQ和pcf基因提高地衣芽孢杆菌发酵 产酶的方法及应用，所得到的基因工程菌地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)DL-1ΔspoⅡQΔpcf 较之出发菌株地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)DL-1在发酵生产性能方面有显著提高。

本发明技术方案如下：

一种高产α-淀粉酶的重组菌，将产α-淀粉酶微生物中的芽孢形成相关基因spoⅡQ和溶 菌相关基因pcf敲除后获得，所述的芽孢形成相关基因spoⅡQ核苷酸序列如SEQ IDNO.1 所示，溶菌相关基因pcf核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

根据本发明优选的，所述产α-淀粉酶微生物为地衣芽孢杆菌；进一步优选的，所述地衣 芽孢杆菌为地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)DL-1。

上述高产α-淀粉酶的重组菌的制备方法，步骤如下：

(1)敲除产α-淀粉酶微生物的芽孢形成基因spoⅡQ，获得重组菌地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)DL-1ΔspoⅡQ；