[发明专利]一种结核分枝杆菌DNA的提取方法

说明书

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种结核分枝杆菌DNA的提取方法，包括步骤：获取结核分枝杆菌，对所述结核分枝杆菌进行灭活处理，得到已灭活的结核分枝杆菌；对所述已灭活的结核分枝杆菌，先进行涡旋振荡分散处理，然后进行超声分散处理，得到结核分枝杆菌分散液；对所述结核分枝杆菌分散液进行破壁处理，得到破壁产物；对所述破壁产物，先采用CTAB/NaCl溶液进行第一次抽提，然后采用酚、氯仿和异戊醇的混合液进行第二次抽提，得到抽提产物；采用异丙醇和糖原对所述抽提产物进行沉淀处理，得到结核分枝杆菌DNA。本发明提取方法，提取质量高，提取方法易于操作，适合在普通生物实验室中进行。

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种结核分枝杆菌DNA的提取方法。

背景技术

结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)是引起结核病的病原菌，可侵犯全身各器官，以肺结核为最多见，结核病至今仍为重要的传染病。因此，对结核分枝杆菌的及时、高效、特异性的检测成为预防、治疗结核分枝杆菌引起病症的有效手段。虽然目前对结核分枝杆菌的生物学特性、致病机制、耐药机制、诊断方法、抗结核药物的研制等方面都取得了一定的成就，但是结核病仍然是影响人类健康流行性最广，病死率最高的感染性疾病之一，寻求快速、准确的诊断方法一直是结核病学首要研究的领域。随着分子生物学的发展，对结核分支杆菌的DNA研究给结核病的诊断带来了新的希望，结核分支杆菌的DNA检测具有高敏感、高特异和快速性等优点。

目前，结核分枝杆菌基因组DNA的制备是应用PCR技术检测结核分枝杆菌核酸和进行全基因组测序的关键。结核分枝杆菌基因组DNA制备有两个难点：一是结核分枝杆菌的细胞壁坚韧，裂解困难，若菌株分散不充分，进一步增加了结核分枝杆菌菌壁裂解，从而影响基因组核酸的释放；二是抽提和沉淀方法直接影响基因组DNA的纯度和浓度。常见的结核分枝杆菌的提取方法有CTAB(hexadecyltrimethylammonium bromide，十六烷基三甲基溴化铵)抽提法和酚氯仿抽提法、Triton法，SDS(sodium dodecyl sulfate，十二烷基硫酸钠)法及胰酶法，其中，CTAB抽提法和酚氯仿抽提法是提取实验中最常用两种方法。

但是，一方面，由于结核分枝杆菌细胞壁坚韧，其培养物聚集程度高，常规的移液器吹打或震荡的方式不易分散菌株，往往导致细胞壁暴露不彻底，不利于溶菌酶的充分作用，从而影响结核分枝杆菌基因组DNA的提取效率。另一方面，为避免DNA断裂，目前结核分枝杆菌基因组DNA抽提方式往往采用单一的提取方式，抽提效果并不稳定，沉淀效率比较低，对少量样本的沉淀效果不佳，致使肉眼无法直接观察到白色基因组DNA沉淀，从而增加了实验人员的操作难度，降低了提取效率。

发明内容

本发明的目的在于提供一种结核分枝杆菌DNA的提取方法，旨在解决现有结核分枝杆菌DNA提取方法对聚集程度高的细胞分散程度差，抽提效果不稳定，沉淀效率低，尤其是对少量样品的沉淀效果不佳等技术问题。

为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：

一种结核分枝杆菌DNA的提取方法，所述提取方法包括以下步骤：

获取结核分枝杆菌，对所述结核分枝杆菌进行灭活处理，得到已灭活的结核分枝杆菌；

对所述已灭活的结核分枝杆菌，先进行涡旋振荡分散处理，然后进行超声分散处理，得到结核分枝杆菌分散液；

对所述结核分枝杆菌分散液进行破壁处理，得到破壁产物；

对所述破壁产物，先采用CTAB/NaCl溶液进行第一次抽提，然后采用酚、氯仿和异戊醇的混合液进行第二次抽提，得到抽提产物；

采用异丙醇和糖原对所述抽提产物进行沉淀处理，得到结核分枝杆菌DNA。

优选地，所述灭活处理的步骤包括：将所述结核分枝杆菌置于TE缓冲液中，在75～85℃的条件下，处理30～60分钟；和/或，