[发明专利]一种结核分枝杆菌DNA的提取方法

权利要求书

1.一种结核分枝杆菌DNA的提取方法，其特征在于，所述提取方法包括以下步骤：

获取结核分枝杆菌，对所述结核分枝杆菌进行灭活处理，得到已灭活的结核分枝杆菌；

对所述已灭活的结核分枝杆菌，先进行涡旋振荡分散处理，然后进行超声分散处理，得到结核分枝杆菌分散液；

对所述结核分枝杆菌分散液进行破壁处理，得到破壁产物；

对所述破壁产物，先采用CTAB/NaCl溶液进行第一次抽提，然后采用酚、氯仿和异戊醇的混合液进行第二次抽提，得到抽提产物；其中，进行所述第一次抽提的步骤包括：获取十二烷基硫酸钠溶液和蛋白酶K溶液，将所述十二烷基硫酸钠溶液和所述蛋白酶K溶液添加到所述破壁产物中，轻柔混匀后，添加NaCl溶液和预热后的所述CTAB/NaCl溶液，再次轻柔混合均匀后，在60℃～70℃水浴条件下处理8～15分钟，得到第一次抽提产物；进行所述第二次抽提的步骤包括：获取与所述第一次抽提产物等体积的所述酚、氯仿和异戊醇混合液添加到所述第一次抽提产物中，混合均匀后，离心处理得到的上清液即为所述抽提产物；其中，所述十二烷基硫酸钠溶液中十二烷基硫酸钠的含量为10％，所述十二烷基硫酸钠溶液的添加量为所述破壁产物体积的14％～15％；所述蛋白酶K溶液的浓度为20mg/ml，添加量为所述破壁产物体积的2％～3％；所述CTAB/NaCl溶液为10％CTAB/0.7mol/LNacl，添加量为所述破壁产物体积的18％～19％；所述酚、氯仿和异戊醇的混合液中酚：氯仿：异戊醇的体积比为25：24：1；

采用异丙醇和糖原对所述抽提产物进行沉淀处理，得到结核分枝杆菌DNA；其中，所述沉淀处理的步骤包括：获取异丙醇和糖原溶液，将所述异丙醇添加到所述抽提产物中，混合均匀后，添加所述糖原溶液，再次混合均匀后，于低于-20℃条件下，低温处理2～3小时，得到低温处理产物；将所述低温处理产物离心处理后，得到的沉淀物采用乙醇离心洗涤处理2～3次，得到的白色沉淀即为所述结核分枝杆菌DNA；其中，所述异丙醇的添加量为所述抽提产物体积的55％～65％；所述糖原溶液的浓度为20mg/ml，添加量为所述抽提产物体积的0.6％～0.7％；所述结核分枝杆菌DNA在使用时，挥发去除其中的乙醇溶剂后，采用缓冲溶液溶解所述结核分枝杆菌DNA。

2.如权利要求1所述的结核分枝杆菌DNA的提取方法，其特征在于，所述灭活处理的步骤包括：将所述结核分枝杆菌置于TE缓冲液中，在75～85℃的条件下，处理30～60分钟；和/或，

所述涡旋振荡分散处理的步骤包括：将所述已灭活的结核分枝杆菌置于缓冲溶液中，在添加有玻璃珠的情况下，涡旋振荡分散2～5分钟，得到涡旋振荡分散产物。

3.如权利要求2所述的结核分枝杆菌DNA的提取方法，其特征在于，所述超声分散处理的步骤包括：对所述涡旋振荡分散产物进行间歇式超声处理2分钟～3分钟，得到所述结核分枝杆菌分散液；其中，所述间歇式超声处理的超声处理时长为2～10秒，暂停时长2～10秒。

4.如权利要求1～3任意一项所述的结核分枝杆菌DNA的提取方法，其特征在于，所述破壁处理的步骤包括：获取溶菌酶，将所述溶菌酶添加到所述结核分枝杆菌分散液中，混合均匀后，在35℃～38℃的条件下水浴消化2小时～24小时，得到所述破壁产物。

5.如权利要求4所述的结核分枝杆菌DNA的提取方法，其特征在于，所述溶菌酶的浓度为50～60mg/ml，添加量为所述结核分枝杆菌分散液体积的3.5％～4.5％；和/或，

所述水浴消化处理的步骤包括：每隔20～30分钟进行一次颠倒混合处理。