[发明专利]含四基因的盒库、重组DNA分子及转基因棉花

说明书

本发明涉及在单/双子叶植物中转化的重组或合成的多核苷酸序列，其包含三个吸吮害虫抗性基因，包括杀虫Tma12基因(SEQ ID NO：18)，PTA基因(SEQ ID NO：19)和ASAL基因(SEQ ID NO：20)和除草Re‑PAT基因(SEQ ID NO：17)，其经编码以在具有组成型靶向表达的转基因植物中提供杀虫和除草毒素蛋白，导致抗性发展减少对抗杀虫毒素蛋白和增加对抗昆虫死亡率的效力，特别是粉虱和蚜虫。本发明还涉及基于插入转基因植物基因组的重组多核苷酸构建体的DNA序列和插入位点侧翼的基因组序列检测转基因事件Kalgin‑5的存在的方法或测定法。

【发明领域】

本发明涉及单和/或双子叶植物的基因工程领域，更具体地说，本发明涉及在转基因植物特异性棉花植物(陆地棉(Gossypium hirsutum))中增强的合成杀虫基因(包括Tma12，PTA和ASAL)和除草基因Re-PAT的表达。本发明还涉及与事件Kalgin-5相关的植物、植物部分、植物种子和/或植物细胞，并提供与事件特有的核苷酸分子，并且与转基因DNA插入棉花植物基因组有关，以及用于检测转基因棉花植物样品中kalgin-5事件的存在的测定法。

【背景技术】

棉花是经济作物，是纺织品原料的重要来源，使纺织业能够生存并扩大其基础。棉花占GDP的1％，农业增加值占5.1％。今年棉花产量大幅下降，为保持纺织工业持续供应，7月原棉进口量同比增加至345,363千吨，同期为97,354千吨，因此增长254.75％被注意到，而在价值方面，它触及588,236百万美元兑224,647,000美元，增长161.85％。棉花播种面积291.7万公顷，比一年前的291.6万公顷土地减少了1.5％。今年的棉花产量为1007.4万包，比去年减产27.8％(巴基斯坦经济调查，2015-16)。

作为巴基斯坦的主要经济作物，它受到广阔和狭窄的杂草的威胁，吸食害虫，包括粉虱，蚜虫和蓟马。粉虱(Bemisia tabaci)被认为是最具侵入性的生物之一，并被列入世界上最严重的外来入侵物种之一。当然，它遍布世界各地的热带和亚热带地区。然而，农产品运输是其全球蔓延的主要原因，这就是为什么它在过去20年中已成为世界上最具破坏性的农业害虫。粉虱通过从韧皮部和其他部位吮吸细胞液，直接损害包括棉花在内的植物，导致生长发育迟缓，早期萎和和过早落叶，最终产生损失，间接由蜂蜜露排泄，促进叶片上的真菌生长和水果表面。此外，它传播许多植物病毒，包括菜豆金色花叶病毒，毛形病毒，Ipomoviruses，Torradoviruse和一些香石竹潜隐病毒。粉虱(Bemisia tabaci)是一种韧皮部饲养者，大多数的菜豆金色花叶病毒是韧皮部受限制的。因此，在组成型和韧皮部特异性启动子的控制下过表达对粉虱的毒素应该从生物安全的角度和有效的控制中更有价值。来自公共和私营部门的不同领域的科学家，除了对环境有害外，即使多种农药一直致力于识别和实施新的抗性策略，也可能发生100％的产量损失。全球粉虱管理主要集中在使用杀虫剂和农药喷雾剂的常规害虫管理实践，因为粉虱(B.tabaci)的农药抗性的发展。转基因作物历史上最广泛的Bt应用技术是细菌来源的杀虫内毒素(苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis))的表达。世界上几种转基因作物生长在广大地区，包括巴基斯坦转基因棉花(单基因)下86％的面积。

这表明到目前为止，开发抗虫植物最实用的方法是使用有效的毒素。聚合多种毒素以干扰目标昆虫的不同途径一直在寻找发展长期抗性的最合理方法，并且应该考虑设计耐久的粉虱(B.tabaci)抗性。已经和最近研究过的毒素对吸吮害虫的综合影响应理想地提供广谱抗性。目前的研究旨在将棉花种子转化为多个基因，这些基因堆叠在单T-DNA下，具有靶向组成型表达，包括韧皮部，可以遇到各种各样的杂草和吸吮昆虫，如烟粉虱和其他广泛的吮吸害虫。

在巴基斯坦农业中，有一项规定是提高棉花种植具有多重和累积抗性的特征，以减少由于各种吸吮害虫造成的产量损失。在本发明中，四基因棉花植物将减少施用可能对其他有益昆虫有害并且最重要的是对环境有害的不同化学和杀虫剂的需要。此外，具有不同作用模式的四基因将有助于延迟吸吮害虫对凝集素/杀虫基因的抗性，这在具有单基因棉的巴基斯坦农业中是普遍存在的问题。