[发明专利]基于酶-无定形金属有机骨架复合物的活细胞胞内葡萄糖浓度的检测方法

说明书

本发明公开了一种基于新型酶‑无定形金属有机骨架复合物的活细胞胞内葡萄糖浓度的检测方法。本发明方法利用新型酶‑定形金属有机骨架复合物以及荧光探针进行活细胞检测，不仅能有效检测活细胞胞内葡萄糖浓度，并且能保持检测后细胞的状态良好。通过本方法可以同时在单细胞和细胞群体两个尺度上有效检测活细胞内的葡萄糖浓度，能够有效区分癌细胞和非癌细胞，在研究细胞的葡萄糖代谢，以及癌症的诊断治疗上具有重要意义。与现有胞内葡萄糖检测方法相比，本发明方法具有操作方便，设备简单，重复性良好，对细胞的损伤较小等多种优势。

技术领域

本发明涉及一种活细胞胞内葡萄糖浓度的检测方法，具体涉及一种基于新型酶-无定形金属有机骨架复合物的活细胞胞内葡萄糖浓度的检测方法。

背景技术

细胞作为生物形态和机构的基本单元，检测胞内葡萄糖浓度对了解细胞的生长、代谢，乃至于疾病的诊断与治疗，都具有重要的意义。不同的组织细胞具有差异性，不同种类细胞的胞内葡萄糖浓度不尽相同，甚至同种细胞间也会有一定差异。理论和实验证据均表明恶性肿瘤细胞的胞内葡萄糖浓度则会显著增加。传统检测细胞内葡萄糖浓度的手段大多需要将细胞破碎后，采用相应的仪器如高效液相色谱等进行检测。因此传统检测手段不仅不能实现活细胞检测，检测结果也基于大量细胞的统计平均，在疾病比如癌症的检测中，往往会遮盖住癌症早期少量癌细胞产生的异常信号，造成漏诊，误诊。因此传统检测手段具有低灵敏度，区分度，且对细胞具有巨大的破坏性。而可以检测单细胞胞内葡萄糖浓度的活细胞检测则为解决上述难题提供了有效的手段。

美国专利(US8173863B2)公开了一种基于荧光共振能量转移的胞内葡萄糖浓度检测方法。该方法公开了一种可以由细胞表达的葡萄糖荧光指示物，比如 FLIPglu600μΔ11，包括葡萄糖结合蛋白，与之共价结合的供体荧光蛋白以及受体荧光蛋白。当葡萄糖与葡萄糖结合蛋白接触后，将使供体荧光蛋白与受体荧光蛋白间的荧光共振能量转移强度发生变化，从而可以作为葡萄糖浓度的指示物。

除上述提到的专利以外，也有文献提出利用葡萄糖氧化酶催化葡萄糖氧化形成葡萄糖酸引起溶液pH变化，从而引起胞质内电导率的变化，通过扫描离子电导显微镜检测胞质内阻抗的变化即可以测量胞内葡萄糖的浓度。以此为原理，Pourmand等人将葡萄糖氧化酶固定在纳米检测探头上，设计了检测单细胞内葡萄糖的“葡萄糖纳米传感器”(NaderPourmand et al.,Nano Lett.,2016,16,1194-1200)。

然而，专利文件US20090083196所公开的方法中，需要将相应蛋白的基因通过基因工程手段导入细胞，因而需要进行较为复杂的操作，此外，该方法受到类型的影响较大，有部分细胞无法表达葡萄糖指示物，这也限制了该方法的进一步应用。Pourmand 等人所提出的纳米探针检测方法需要制备较为复杂的纳米探针，检测中所必须的扫描离子电导显微镜也造成该实验复杂程度上升。此外该方法检测过程中对细胞的穿刺也会对细胞造成一定的损伤。因而提出一种简单可靠，对细胞的破坏性较小，并且能同时在细胞群体和单细胞尺度上检测细胞内葡萄糖浓度的方法颇具挑战和意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种活细胞内葡萄糖浓度的检测方法，本发明方法基于一种新型酶-无定形金属有机骨架复合物，可以同时从细胞群体以及单细胞尺度检测活细胞胞内葡萄糖浓度。

本发明所提供的细胞胞内葡萄糖浓度的检测方法，包括如下步骤：

(1)向至少四种(优选四种至六种)离体的细胞中分别加入下述1)或2)，然后在活细胞成像系统上测定激发波长和发射波长分别为488nm和525nm处的荧光强度随时间的变化，所述荧光强度的最大值的差值F₁即为测定的细胞的荧光强度；

1)体积相同的2’,7’-二氯二氢荧光素-乙酰乙酸酯的溶液和酶-无定形金属有机骨架复合物的浊液；

2)体积相同的磷酸缓冲液或磷酸盐缓冲液和酶-无定形金属有机骨架复合物的浊液；