[发明专利]基于酶-无定形金属有机骨架复合物的活细胞胞内葡萄糖浓度的检测方法

权利要求书

1.一种非治疗和/或诊断目的的细胞胞内葡萄糖浓度的检测方法，包括如下步骤：

（1）向至少四种离体的细胞中分别加入下述1）或2），然后在活细胞成像系统上测定激发波长和发射波长分别为488nm和525nm处的荧光强度随时间的变化，所述荧光强度的最大值的差值F₁即为测定的细胞的荧光强度；

1）体积相同的2’,7’-二氯二氢荧光素-乙酰乙酸酯的溶液和酶-无定形金属有机骨架复合物的浊液；

所述2’,7’-二氯二氢荧光素-乙酰乙酸酯的浓度为1~10μM；

2）体积相同的磷酸缓冲液或磷酸盐缓冲液和酶-无定形金属有机骨架复合物的浊液；

所述酶-无定形金属有机骨架复合物的浊液中所述酶-无定形金属有机骨架复合物的质量-体积浓度为10~20μg/mL；

所述荧光强度的最大值的差值F₁指的是加入1）后的体系与加入2）后的体系所测定的荧光强度的最大值的差值；

所述2’,7’-二氯二氢荧光素-乙酰乙酸酯的溶液和所述酶-无定形金属有机骨架复合物的浊液均由所述磷酸缓冲液或所述磷酸盐缓冲液配制；

所述酶-无定形金属有机骨架复合物呈平均粒径为100~200nm的颗粒状；

于pH为中性的条件下，所述酶-无定形金属有机骨架复合物的表面电荷为18~25mV；

所述酶-无定形金属有机骨架复合物由包括如下步骤的方法制备：

将葡萄糖氧化酶、锌离子和2-甲基-1H-咪唑在溶剂中进行反应即得；

制备所述酶-无定形金属有机骨架复合物的方法具体如下：

将可溶性锌盐的溶液加入至所述2-甲基-1H-咪唑的溶液中，产生沉淀后加入所述葡萄糖氧化酶的溶液，经搅拌后离心分离即可；

所述可溶性锌盐的溶液中所述锌离子的浓度为15~25mM，所述2-甲基-1H-咪唑的溶液中所述2-甲基-1H-咪唑的浓度为70~90mM，所述葡萄糖氧化酶的溶液中所述葡萄糖氧化酶的质量体积浓度为0.5~1mg/mL；

所述锌离子来自于所述可溶性锌盐；

所述可溶性锌盐的溶液、所述2-甲基-1H-咪唑的溶液与所述葡萄糖氧化酶的溶液均由所述溶剂配制；

所述活细胞成像系统为激光共聚焦高内涵活细胞成像系统；

（2）将至少四种离体的所述细胞分别经胰蛋白酶消化后进行计数，然后进行细胞破碎，取上清液并设置浓度梯度；取葡萄糖标准溶液，并设置浓度梯度；分别向所述上清液和所述葡萄糖标准溶液中加入含有葡萄糖氧化酶、辣根过氧化物酶和ABTS的溶液，反应结束后测定415nm处的吸光度变化，得到含有每种细胞的所述上清液和所述葡萄糖标准溶液的吸光度-样品体积曲线，经线性拟合得两条直线，由所述直线的斜率即得到所述细胞内的葡萄糖浓度，由至少四种所述细胞的荧光强度和所述细胞内的葡萄糖浓度关系，得到荧光强度和细胞内葡萄糖浓度之间的标准曲线；

所述葡萄糖标准溶液的浓度为0~100μM，但不为零；

（3）按照步骤（1）的方法测定待测细胞群或单细胞的荧光强度，根据步骤（2）得到的所述标准曲线，即得到所述细胞群或所述单细胞内的葡萄糖浓度。

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述磷酸缓冲液或所述磷酸盐缓冲液的pH为7.2~7.5，浓度为5~20mM。

3.根据权利要求1或2所述的检测方法，其特征在于：步骤（1）中，为了使所述酶-无定形金属有机骨架复合物充分分散，所述方法还包括对所述酶-无定形金属有机骨架复合物的浊液进行超声分散的步骤。

4.根据权利要求1或2所述的检测方法，其特征在于：步骤（2）中，采用所述磷酸盐缓冲液或所述磷酸缓冲液洗涤经所述胰蛋白酶消化后的细胞；

采用所述磷酸盐缓冲液或所述磷酸缓冲液重悬后进行细胞计数。