[发明专利]一种检测茶卡羊BAG4基因CNV标记的方法及其应用

说明书

本发明公开了一种检测茶卡羊BAG4基因CNV标记的方法及其应用：基于实时荧光定量PCR技术，以茶卡羊血样全基因组DNA为模板，扩增茶卡羊BAG4基因的拷贝数变异区域，并以扩增的茶卡羊ANKDR1基因片段作为内参，利用2^‑ΔCt的方法计算个体的拷贝数，通过对拷贝数变异与生长性状进行关联分析，该拷贝数变异区域的不同基因型显著影响茶卡羊的生长性状，本发明在DNA水平上检测与茶卡羊生长性状密切相关的分子遗传标记，可用于茶卡羊生长性状的标记辅助选择，从而快速建立优良的茶卡羊种群，该方法具有简单、快速，便于推广应用的特点。

技术领域

本发明属于分子遗传学领域，涉及基因拷贝数变异(CNV)的检测，特别涉及一种检测茶卡羊BAG4基因拷贝数变异的方法，该方法以基因组DNA为模板，以ANKRD1基因为参照，根据2*2^-ΔCt值从而确定个体的拷贝数是否插入或缺失。

背景技术

青海高原毛肉兼用半细毛羊，最早是在茶卡地区进行改良繁殖的，又名茶卡羊。茶卡羊是由新疆细毛羊和茨盖羊与当地的藏羊和蒙古羊杂交，后又引入罗姆尼羊进行横交固定培育而成，对严酷的高寒环境条件具有良好的适应性，对饲养管理条件的改善反应明显。

随着基因组学和生物信息学等相关学科的迅猛发展，揭开了动物生长发育的各种生物学机制。动物的体尺性状和产肉及产毛的质量是由多种基因共同调控的。现在认为分子标记辅助选择中通过提高优秀的分子标记频率对于动物基因的发展是有效的。随着对基因组研究的深入，有证据证明拷贝数变异(copy number variations,CNVs)可能影响基因网络并调节相关基因的表达，促成个体表型的可变性，因此优化与体尺性状相关的候选CNVs等DNA标记，可以加速羊的遗传育种进程。

拷贝数变异一般是指在全基因组范围大于50bp的缺失、复制和插入的结构变异，是基因组内发生重排导致的，可以通过剂量效应影响改变对剂量效应敏感基因的表达水平；通过产生融合基因，还有基因功能阻断、位置效应、隐性等位基因的去除效应等影响基因的功能和个体间的表型。

目前，人和动物全基因组范围内的CNVs筛查方法主要有三种：微阵列比较基因组杂交芯片(array-based comparative genomic hybridization,aCGH)、二代测序技术(Next-Generation Sequencing,NGS)和SNP芯片技术。在比较基因组杂交芯片中寡核苷酸探针芯片被广泛使用，具有高灵敏度、高精度和样本量小的特点，此外，现有的芯片平台对新的拷贝数变异的检测效率很低。随着二代测序技术的发展，当前最有效的检测手段是通过重测序来检测基因组结构变异，但这种方法相较之前的方法成本较高。

对基因组己知的CNV检测主要有两种方法：基于PCR的检测技术和基于杂交的检测技术。PCR的检测技术主要包括实时荧光定量PCR(qPCR)、依赖连接的多重扩增探针杂交技术(Multiplex Ligation-Dependent Probe Amplification,MLPA)和短片段多重定量技术(Quantitative Multiplex PCR of Short Fluorescent Fragments,QMPSF)。目前使用最广泛的是qPCR技术，该方法敏感性高、操作方法简单、速度快、重复性好且污染少，但不适用于大样本的高通量检测。杂交技术主要包括Southern blotting杂交、荧光原位杂交(Fluorescence in situ hybridization,FISH)、多重扩增探针杂交技术(MultiplexAmplifiable Probe Hybridization,MAPH)等，但这些方法成本比较高，时间长而且不够准确，目前使用较少。