[发明专利]一种抗菌蛋白及其编码基因和分离纯化方法

说明书

本发明涉及微生物农药与微生物肥料领域，特别涉及一种抗菌蛋白及其编码基因和分离纯化方法。该蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。本发明通过硫酸铵分段沉淀，再通过DEAE Sepharose FF及Sephadex G‑100凝胶层析优化了目的蛋白的分离程序，从GZ‑5菌株的发酵液中分离纯化到一种分子量约为32‑35kDa的抗菌蛋白，该抗菌蛋白抗菌谱广、抑菌活性好，且抗菌蛋白的稳定性较好，除对高温较敏感，对紫外辐射、pH等均较稳定，在微生物蛋白质农药的开发方面具有广泛的应用价值。

技术领域

本发明涉及微生物农药与微生物肥料领域，特别涉及一种抗菌蛋白及其编码基因和分离纯化方法。

背景技术

抗菌蛋白具有杀死或抑制病原菌生长的功能，其广泛存在于自然界的生物体中，在动植物及微生物体内均能发现其踪迹，是生物体内一类天然防御性物质。而且与脂肽类、大环内脂类等非蛋白类物质相比，大多数抗菌蛋白除具有较强的抑菌作用外，其分子量约在10～60kDa之间，较容易克隆到其编码基因，用于高效生防工程菌的构建或转基因抗病作物的培育。目前抗菌蛋白的开发与研究主要有两个途径，分别为植物源的和微生物源的抗菌蛋白。来源于植物体的抗菌蛋白由于本身是植物的组成部分或代谢产物，一般比较稳定，但其表达量相对较低、活性较弱，难以抵抗大量真菌的入侵与为害，因此，从细菌、放线菌等微生物中分离抗菌蛋白，特别是从芽孢杆菌发酵液中提取抗菌蛋白并将其用于植物病害的防治，具有广阔的理论研究价值和开发应用前景。

抗菌蛋白分离提取的关键在于建立一套合理的分离纯化流程。目前抗菌蛋白的分离纯化主要有盐析法、透析法、离子交换层析、葡聚糖凝胶层析、电泳等，蛋白质的分离和提纯工作是一项艰巨而繁重的任务，到目前为止，还没有一个单独的或一套现成的方法能把任何一种蛋白质从复杂的混合物中提取出来，但对任何一种蛋白质都有可能选择一套适当的分离提纯程序来获取高纯度的制品。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种抗菌蛋白及其编码基因和分离纯化方法。该抗菌蛋白抗菌谱广、抑菌活性好，且抗菌蛋白的稳定性较好，除对高温较敏感，对紫外辐射、pH等均较稳定。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

本发明还提供了编码该蛋白的基因。

在本发明中，编码上述蛋白的基因的碱基序列如SEQ ID NO：2所示。但基于密码子的简并性，编码上述蛋白的基因不只限定于SEQ ID NO：2所示序列，只要能够编码如SEQ IDNO：1所示蛋白即可。

本发明还提供了该蛋白在制备抗菌药物中的应用。

在本发明具体实施例中，抗菌药物为抑制梨黑斑病菌、番茄灰霉病菌、立枯丝核病菌中一种或几种菌的药物。

本发明还提供了该蛋白的分离纯化方法，包括如下步骤：

步骤1：将解淀粉芽孢杆菌GZ-5菌株发酵液采用硫酸铵进行盐析，得到蛋白粗提物；

步骤2：将蛋白粗提物采用Tris-HCl缓冲液溶解，利用DEAE Sepharose FF离子交换层析柱将所得蛋白粗提物溶液进行线性梯度洗脱，回收第三个洗脱峰的洗脱液，经浓缩得到浓缩液；

步骤3：将浓缩液采用Sephadex G-100层析柱进行洗脱，回收第一个洗脱峰的洗脱液。

作为优选，硫酸铵的饱和度为60％～80％。

优选地，硫酸铵的饱和度为80％。

作为优选，线性梯度洗脱的洗脱液为20mmoL/L Tris-HCl缓冲液和0～1.5moL/LNaC1。

作为优选，步骤2中溶解所需的Tris-HCl缓冲液的浓度为20mmol/L，pH为7.6。