[发明专利]外周血记忆T细胞培养方法

说明书

本发明涉及一种外周血记忆T细胞培养方法，所述方法包括：a)将由外周血分离得到的PBMC进行磁珠分选得到CD8⁺T细胞；将所述CD8⁺T细胞接种于包被有CD3抗体及CD28抗体的培养容器中进行培养；培养体系中含自体血浆，且细胞因子主要包括IFN‑γ以及IL‑2；b)换液进行扩增培养，新培养体系中含自体血浆，且细胞因子主要包括IL‑2，IL‑1a，IL‑7，IL‑15；c)将扩增好的T细胞与DC细胞共培养；其中所述DC细胞预先与自体肿瘤抗原共培养。本发明能够有效在体外扩增记忆T细胞，并有效提高活性记忆T细胞的比例。

技术领域

本发明涉及细胞培养技术领域，具体而言，涉及一种外周血记忆T细胞培养方法。

背景技术

T细胞根据其分化程度可分为初始T细胞，记忆T细胞，效应T细胞。初始T细胞在胸腺中发育成熟迁移至外周淋巴组织中(如脾脏、淋巴结)。肿瘤患者体内初始T细胞接触肿瘤细胞表面肿瘤相关抗原(TAA)，在APC细胞的识别和呈递下，以及一系列的信号通路，增殖分化为效应T细胞和记忆T细胞。效应T细胞和记忆T细胞有着不同的功能，前者分泌穿孔素、颗粒素酶和颗粒溶素等物质，并通过Fas配体直接杀伤肿瘤细胞，但在体内存活时间较短(3～4个月)，且无法继续增殖。高度分化的细胞毒性T细胞(Cytotoxic Lymphocyte，CTL)是效应T细胞，在体内的半衰期大约只有15天。记忆T细胞能够在血液系统中长期存在(10～20年)，遇到TAA后还能再次被激活，并分裂增殖为具有杀伤功能的效应性T细胞(CTL)。

免疫记忆是获得性免疫应答的主要特征。机体对抗原初次应答后，形成的效应信息可存留在机体免疫系统。免疫记忆的物质基础是处于静息态的记忆T细胞和记忆B细胞，其中记忆T细胞尤为重要，是机体有效清除各种病原体的关键。

记忆T细胞的形成分为三步：第一，T细胞在抗原刺激下被活化，不断增殖形成大量效应T细胞，以清除相应的抗原；第二，抗原清除后，90％以上的效应T细胞死亡，被机体清除；第三，留存下来的T细胞，进入静息期，在机体内维持一定的数量，成为记忆T细胞。

CD8⁺记忆性T细胞的维持不需要抗原的持续刺激，记忆性T细胞的再激活只需要较低的抗原浓度，相比于初始T细胞对共刺激信号依赖弱,相比初始T细胞对抗原的反应速度更快。记忆性T细胞再次激活后可迅速通过分裂增殖产生大量具有免疫效应的效应T细胞，并释放大量有效的细胞因子，如IFN-γ、IL-4和TNF-α等，从而增强抗肿瘤细胞的功效。

目前，肿瘤过继T细胞治疗多采用CD8⁺T细胞，但是这些终末分化的效应T细胞在人体和小鼠中的抗肿瘤效果是短暂且不稳定的。而记忆T细胞拥有较强的生存能力和快速的二次免疫，因此通过体外的特异性肿瘤抗原的初次免疫和抗原呈递细胞的共同刺激，在体内可以发挥更强的肿瘤杀伤功能。然而现有的记忆T细胞体外培育方法，普遍存在扩增记忆T细胞倍率低、细胞活性差等问题。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明涉及一种外周血记忆T细胞培养方法，包括：

a)将由外周血分离得到的PBMC进行磁珠分选得到CD8⁺T细胞；

将所述CD8⁺T细胞接种于包被有CD3抗体及CD28抗体的培养容器中进行培养；培养体系中含4％～6％自体血浆，且细胞因子主要包括IFN-γ900U/mL～1100U/mL以及IL-2900U/mL～1100U/mL；

b)换液进行扩增培养，新培养体系中含4％～6％自体血浆，且细胞因子主要包括IL-2 900U/mL～1100U/mL，IL-1a 900U/mL～1100U/mL，IL-7 900U/mL～1100U/mL，IL-1515ng/mL～25ng/mL；