[发明专利]外周血记忆T细胞培养方法

权利要求书

1.一种外周血记忆T细胞培养方法，其特征在于，包括：

a)将由外周血分离得到的PBMC进行磁珠分选得到CD8⁺T细胞；

将所述CD8⁺T细胞接种于包被有CD3抗体及CD28抗体的培养容器中进行培养；培养体系中含4％～6％自体血浆，且细胞因子主要包括IFN-γ900U/mL～1100U/mL以及IL-2 900U/mL～1100U/mL；

b)换液进行扩增培养，新培养体系中含4％～6％自体血浆，且细胞因子包括IL-2900U/mL～1100U/mL，IL-1a 900U/mL～1100U/mL，IL-7 900U/mL～1100U/mL，IL-15 15ng/mL～25ng/mL；

c)将扩增好的T细胞与DC细胞共培养；其中所述DC细胞预先与自体肿瘤抗原共培养；

所述自体肿瘤抗原的制备方法包括：

将肿瘤组织经机械破碎后重悬于抗原提取液后经280W～320W超声破碎50s～70s，冰浴震荡，离心后将上清低温透析；

所述磁珠分选包括：

a¹)将所述PBMC计数后离心，用磁珠分选液重悬PBMC并孵育得到孵育液；

以所述PBMC为10⁷细胞计，所述磁珠分选液主要包含80μL～100μL MACS缓冲液以及8μL～12μL CD8⁺T细胞生物素标记抗体；

a²)将所述孵育液与17μL～23μL抗生物素磁珠接触并再次孵育；

a³)过分选柱，弃去流下来的细胞，用MACS缓冲液冲洗柱子，收集流下的液体得到CD8⁺T细胞；

在步骤a)中，所述培养体系中的基础培养基为VIVO培养基；

所述抗原提取液的下述组分在水溶液中的工作浓度在以下范围内：

-金属离子螯合剂4mM～6mM，

-碘乙酰胺2nM～3nM，

-Zwittergent 3-0.18g/mL％～0.28g/mL％，以及

-缓冲组分；

且所述抗原提取液在抗原提取的过程中的pH为8.2～8.6。

2.根据权利要求1所述的外周血记忆T细胞培养方法，其特征在于，在步骤a)中，以培养面积为25cm²计，培养基的加入量为12mL～18mL，细胞接种量为0.8×10⁷～1.2×10⁷。

3.根据权利要求2所述的外周血记忆T细胞培养方法，其特征在于，步骤a)中的培养时间为20h～28h。

4.根据权利要求1所述的外周血记忆T细胞培养方法，其特征在于，在步骤b)中，所述培养体系中的基础培养基为AIM-V培养基。

5.根据权利要求1所述的外周血记忆T细胞培养方法，其特征在于，步骤b)中的培养时间为5～7天。

6.根据权利要求1所述的外周血记忆T细胞培养方法，其特征在于，步骤c)中的培养时间≤7天。