[发明专利]一种适用于转基因杜鹃的阳性基因检测方法

说明书

本发明提供一种适用于转基因杜鹃的阳性基因检测方法，属于转基因检测技术领域，包括总DNA的提取；以Bar‑F：CCACTCGTAACCAGTAAGCC，Bar‑R：GTAGGACGACTCAGTGTA，EF1α‑F:TGTTGCAAAGACGACCGAC，EF1α‑R：CGGCCATCTGTAGCGATCTT作为引物，进行PCR反应；电泳；回收PCR产物；地高辛标记探针；基因组DNA酶切；转膜、固定；杂交；洗膜、信号检测。本发明从DNA提取，PCR反应条件、基因组DNA酶切、固定、杂交、洗膜条件进行优化，提供一种快速、方便、价格较低、高效的检测转基因杜鹃的阳性基因的Southern杂交方法。

技术领域

本发明属于转基因检测技术领域，具体涉及一种适用于转基因杜鹃的阳性基因检测方法。

背景技术

杜鹃花是杜鹃花科(Ericaceae)杜鹃花属(Rhododendron)植物的总称，杜鹃花以绮丽多姿，高雅脱俗赢得了“花中西施”的美誉，杜鹃花不仅是世界园林最为著名的观赏植物，也是我国传统十大名花之一。杜鹃花种类繁多、色彩艳丽，形态各异，花期亦长，它不仅可以种植在林缘、溪边、池畔及岩石旁成丛、成片种植，也可以植于庭院中作为盆景。目前，国际上无论在宏观领域还是微观领域对杜鹃花都有比较深入的研究，在新品种的选育上成效显著，比利时、美国、英国、日本、德国等培育了大量极具商品性的品种。近年来在中国，杜鹃花的育种工作也日渐引起重视。

Southern杂交技术由英国科学家埃德温·迈勒·萨瑟恩于1975年创立，此技术现已成为检测特定DNA片段的经典方法。该方法利用硝酸纤维膜或尼龙膜等可以吸附DNA的功能，将DNA电泳后的DNA区带吸附到膜上，随后在膜上进行同位素标记探针与被测DNA之间的杂交，最后通过放射自显影对杂交结果进行检测，以此探测DNA样品中含有的特定DNA信息。Southern杂交技术特异性强，灵敏性高，可应用于检测样品中DNA及其含量，了解基因的状态，如是否存在点突变、扩增重排等，在遗传病诊断、外源基因检测、DNA图谱分析、PCR产物分析等方面均有广泛应用。目前地高辛标记的Southern杂交技术已成功运用到棉花、烟草、水稻、玉米、油菜、小麦等农作物中并取得了良好的杂交效果。

发明内容

本发明的目的在于提供一种适用于转基因杜鹃的阳性基因检测方法，该检测方法固定效果好，价格低；能够避免探针与尼龙膜及非特异性核酸的结合，从而使杂交效果较好。

本发明为实现上述目的所采取的技术方案为：

一种适用于转基因杜鹃的阳性基因检测方法，包括：

总DNA的提取；

采用紫外分光光度计对DNA溶液进行质量测定和浓度定量；

PCR反应：以EF1α基因作为内参基因，Bar基因为目的基因，引物序列为Bar-F：CCACTCGTAACCAGTAAGCC，Bar-R：GTAGGACGACTCAGTGTA，EF1α-F:TGTTGCAAAGACGACCGAC，EF1α-R：CGGCCATCTGTAGCGATCTT；

琼脂糖凝胶电泳；