[发明专利]一种适用于转基因杜鹃的阳性基因检测方法

权利要求书

1.一种适用于转基因杜鹃的阳性基因检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)总DNA的提取；

2)采用紫外分光光度计法对DNA溶液进行质量测定和浓度定量；

3)PCR反应：以EF1α基因作为内参基因，Bar基因为目的基因，引物序列为Bar-F：CCACTCGTAACCAGTAAGCC，Bar-R：GTAGGACGACTCAGTGTA，EF1α-F:TGTTGCAAAGACGACCGAC，EF1α-R：CGGCCATCTGTAGCGATCTT；

4)琼脂糖凝胶电泳；

5)Southern杂交：回收PCR产物；地高辛标记探针；转基因杜鹃基因组DNA酶切；转膜；固定；杂交；洗膜；信号检测。

2.根据权利要求1所述的一种适用于转基因杜鹃的阳性基因检测方法，其特征在于：所述总DNA的提取在研磨材料时加入0.2-0.4mL质量体积分数1-2％的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。

3.根据权利要求1或2所述的一种适用于转基因杜鹃的阳性基因检测方法，其特征在于：所述PCR反应以1.0-1.5μL浓度为18-23ng/μL的DNA为模板。

4.根据权利要求1或2所述的一种适用于转基因杜鹃的阳性基因检测方法，其特征在于：所述PCR反应体系中分别加入EF1α基因引物和Bar基因引物0.4-0.45μL。

5.根据权利要求1或2所述的一种适用于转基因杜鹃的阳性基因检测方法，其特征在于，所述PCR反应条件为：94-95℃预变性3-5min，94-95℃变性30-40S，58-59℃退火30-35S，72-74℃延伸30-35S；共30-35个循环；72℃延伸5-6min，2-4℃冷藏10-12min。

6.根据权利要求1或2所述的一种适用于转基因杜鹃的阳性基因检测方法，其特征在于：所述转基因杜鹃基因组DNA酶切体系为：在360-380μL体系中加入30-35μL DNA，6-8μL限制性内切酶HindⅢ，酶切12-14h。

7.根据权利要求1或2所述的一种适用于转基因杜鹃的阳性基因检测方法，其特征在于：所述转基因杜鹃基因组DNA酶切中酶切后的DNA置于2-4℃冷藏，加样前56-58℃水浴2-3min。

8.根据权利要求1或2所述的一种适用于转基因杜鹃的阳性基因检测方法，其特征在于：所述固定是采用紫外交联法将DNA固定到尼龙膜上，并添加一定量阳离子聚丙烯酰胺。

9.根据权利要求1或2所述的一种适用于转基因杜鹃的阳性基因检测方法，其特征在于，所述杂交的步骤包括：

1)将浸湿的DNA滤膜放入杂交瓶中，加入杂交液；

2)向杂交管中加入羧甲基纤维素后，放入42-44℃的杂交炉中预杂交45-75min；

3)探针在95-100℃变性8-10min，立即放置在冰上4-7min；

4)除去预杂交液，加入新的杂交液5-7mL，再加入变性好的探针5-6μL，64-66℃杂交16-18h。

10.根据权利要求1或2所述的一种适用于转基因杜鹃的阳性基因检测方法，其特征在于，所述洗膜的步骤包括：

1)取28-30ml含有0.08-0.1％十二烷基硫酸钠(SDS)的0.04-0.5×柠檬酸钠缓冲液(SSC)，常温洗膜2-3次，每次6-8min；

2)取28-30ml含有0.08-0.1％十二烷基硫酸钠的0.04-0.5×柠檬酸钠缓冲液，63-64℃洗膜2-3次，每次15-18min。