[发明专利]猝灭荧光RNA标志物合成方法及应用于食源性致病菌检测的方法

说明书

本发明公开了一种猝灭荧光RNA标志物合成方法及应用于食源性致病菌检测的方法，采用一步溶剂热法合成带有氨基修饰的上转换纳米颗粒，将特定的RNA与猝灭剂结合合成RNA荧光标志物，采用戊二醛交联法将RNA荧光标志物与带有氨基修饰的上转换纳米颗粒连接在一起得到猝灭荧光RNA标志物；并将猝灭荧光RNA标志物应用于食源性致病菌的检测，核酸酶Cas13a对痕量致病菌细胞中的特定核酸靶标进行精确切割，并利用该酶的附带切割效应，剪切猝灭荧光RNA标志物，释放可被检测的荧光；采集荧光光谱数据，构建荧光强度变化值与不同量食源性致病菌核酸靶标的定量检测模型，实现食源性致病菌核酸的纳米荧光痕量检测。

技术领域

本发明属于食源性致病菌检测技术领域，尤其涉及一种猝灭荧光RNA标志物合成方法及应用于食源性致病菌检测的方法。

背景技术

食源性致病菌是引发食源性疾病的主要原因之一，是世界食品安全的重要，已严重威胁到人类健康。食源性致病菌的检测是食品安全保障的重要手段。伴随着核酸检测技术的快速发展，各种食源性致病菌的快速检测方法相继而生。常用的有聚合酶链式反应及其衍生技术、核酸恒温扩增技术、寡核苷酸微阵列技术和免疫磁性细胞分离技术等。现有的这些方法虽各有优势，但存在检测周期长或者检测时荧光背景太强等缺陷。鉴于申请人在食品无损检测领域积累的良好经验以及团队成员熟练的分子生物学基础，特别是在上转换荧光检测技术以及CRISPR/Cas技术领域的深入研究，本项目拟构建一种食源性致病菌的上转换纳米荧光超灵敏检测方法，深入探究快速、灵敏的食源性致病菌核酸定量检测方法，该方法适用于食品安全、环境监测等技术领域。

目前，运用上转换荧光纳米技术实现食源性致病菌核酸的快速检测方法仍未报道。本发明作为一种新颖的食源性致病菌核酸定量方法，实现食源性致病菌核酸的快速检测

发明内容

本发明根据现有技术中存在的问题，提出了一种猝灭荧光RNA标志物合成方法及应用于食源性致病菌检测的方法。

本发明所采用的技术方案如下：

一种猝灭荧光RNA标志物合成方法；

采用一步溶剂热法合成带有氨基修饰的上转换纳米颗粒，将特定的RNA与猝灭剂结合合成RNA荧光标志物，采用戊二醛交联法将RNA荧光标志物(NH₂-RNA-BHQ)与带有氨基修饰的上转换纳米颗粒(NH₂-UCNP_S)连接在一起得到猝灭荧光RNA标志物；

进一步，所述上转换纳米颗粒粒径大小100nm，通过添加NH₄F的量来调节粒径大小；

进一步，所述上转换纳米颗粒荧光颜色通过调节稀土元素掺杂比例来控制；

进一步，上转换荧光纳米颗粒为NaGdF₄:Yb/Er、NaGdF₄:Yb/Tm或NaGdF₄:Yb/Ho；

进一步，所述猝灭剂采用BHQ系列荧光猝灭剂，提高检测灵敏度。

一种食源性致病菌的上转换纳米荧光超灵敏检测方法，运用新型核酸酶Cas13a对痕量致病菌细胞中的特定核酸靶标进行精确切割，并利用该酶的附带切割效应，剪切猝灭荧光RNA标志物，释放可被检测的荧光；借助上转换荧光光谱系统采集荧光光谱数据，获取上转换荧光纳米材料最大吸收峰的荧光强度值，构建荧光强度变化值与不同量食源性致病菌核酸靶标的定量检测模型，实现食源性致病菌核酸的纳米荧光痕量检测。

本发明的有益效果：