[发明专利]一种高通量筛选高产油裂殖壶菌突变体的方法

说明书

本发明属于基因工程技术领域，公开了一种高通量筛选高产油裂殖壶菌突变体的方法，筛选条件优化：进行裂殖壶菌尼罗红染色条件优化、选用单位细胞密度油脂量作为筛选依据、确定尼罗红的染色时间点；高通量筛选；利用紫外(UVC)诱变建立随机突变体库，再进行96孔板接种培养、OD595测量、尼罗红染色、数据分析、复筛；对复筛中的FI/OD₅₉₅前三的突变体，进行表型验证，以证实筛选方案的正确性。本发明操作简单，更准确，目的性强；高通量作业，工作量较小，适合大规模育种；筛选效率高，筛选得到高产油、高产DHA突变株整个流程需花费3周时间，大大缩短育种周期。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，尤其涉及一种高通量筛选高产油裂殖壶菌突变体的方法。

背景技术

目前，最接近的现有技术：

DHA的作用和功效

二十二碳六烯酸(Docosahexenoic acid,DHA)是一种具有重要生理功能的ω-3系列长链不饱和脂肪酸，作为一种重要的营养成分，它具有促进婴幼儿大脑视网膜发育、预防多种心血管疾病以及提高机体免疫能力等重要生理功能。因此，DHA已被广泛应用于婴幼儿食品、保健品、医药和养殖等行业，人们对DHA的需求也日益增加。

裂殖壶菌合成的富含DHA油脂是工业化生产DHA的新型来源。为了获得适用于工业化的高产油、高产DHA的裂殖壶菌工程株，我们设计了一套操作简单的基于尼罗红染色的高通量筛选方案。

现有的筛选高产DHA裂殖壶菌突变株的方法主要有：

1).菌株诱变后挑选生长快速的突变株，该方法主要是依据菌落形态大小来判断的，而且目标菌株往往需要多轮验证，因此，此方法存在肉眼观察不可确信性、工作量大和时间成本较高等缺点。

2).诱变后添加相关酶抑制剂，该方法是通过抑制DHA合成通路中某个关键酶来反向筛选出该酶活性强的突变体，而判断依据往往也是通过菌落形态大小来判断，而且目标菌株也需要多轮验证。因此，此方法也存在方法一中同样的缺点，而且筛选出来的突变株存在特征单一性，不适用于工业应用。

3).利用DHA的特性如抗氧化性和增加细胞流动性来改变筛选条件，此方法筛选依据方法一，假阳性较高，验证过程漫长。

4).采用驯化手段，通过连续胁迫条件如高氧、高盐来驯化菌株，此方法虽能部分提高DHA产量，但其驯化周期过长，且易于恢复，菌株稳定性不足，并不适合大规模育种。

综上所述，现有技术存在的问题是：

(1)现有技术中，采用的一般筛选流程为：平板筛选-试管筛选-摇瓶筛选，而在每轮筛选中需要对所筛突变株的油脂含量和DHA含量进行一一验证，这会大大增加实验的工作量，即存在弊端如筛选的通量不高，工作量大。

(2)现有技术中，虽有人利用尼罗红染色来检测油脂含量，但在实际筛选过程由于各个突变体的细胞密度不一样，若直接使用尼罗红染色荧光作为筛选依据的话，会增加结果的假阳性。

(3)现有技术中，会采用多种诱变方式，然后加入一些起筛选作用的化合物，虽也能筛选出高产油突变体，但存在多种诱变方式操作复杂、成本较高的问题，以及加入化合物都存在一定毒性或致癌，存在安全问题，而且筛选的周期较长，假阳性较高。这就增加了验证过程，增加工作量。

解决上述技术问题的难度：

现有技术不易解决或只能部分解决上述问题。

解决上述技术问题的意义：

(1)可以大大增加高产油、高产DHA裂殖壶菌突变体的育种效率，而裂殖壶菌在工业上具有广泛的应用。

(2)能够降低大规模育种的门槛，较低的硬件条件就可以实施本方案。增加筛选效率的同时，操作更简单，成本更低，更安全。