[发明专利]一种孕妇外周血胎儿DNA的富集方法

说明书

本发明提供了一种孕妇外周血胎儿DNA的富集方法，本发明主要通过固定特异性抗体的磁性微球与孕妇血浆内的外泌体结合，捕获胎儿外泌体，从而从胎儿外泌体中提取DNA。本发明方法能从孕妇血浆/血清中分离胎儿外泌体，并且从中提取胎儿DNA，非常高效的获得极其微量的胎儿DNA，方法简单、实用、高效，也适用于多个样本的同时处理。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种孕妇外周血胎儿DNA的富集方法。

背景技术

在我国，每年新生儿出生缺陷多达80万-120万，尽早进行产前筛查和诊断是最优先的应对措施，然而目前常规的诊断方法都是有创伤性的方法，对胎儿和孕妇都有一定危险性，因此发展新的无创性产前诊断的方法具有重要的临床意义。1997年Lo等发现在孕妇外周血液就中存在少量的游离胎儿DNA，从而使无创性产前诊断成为可能。

然而孕妇外周血中游离的胎儿DNA含量稀少，而且与血浆中大量的母体DNA混杂在一起，这给胎儿游离DNA的检测与分离造成了极大的困难，如何从孕妇外周血中高效富集游离的胎儿DNA成为了当前相关研究的焦点。

目前，从母体血浆中分离游离胎儿DNA的方法有很多，包括电泳富集和磁珠分离法等。但是由于胎儿DNA含量低，而且胎儿DNA的片段大小与母体循环DNA的片段大小差异不明显，有部分是片段长度相同，因此实际上很难用电泳这类方法通过不同大小的片段的分离来实现胎儿DNA的高效富集，这种方法还存在大量损伤，容易造成污染；而目前基于磁珠的分离方法特异性不高，回收率低，而且成本较高，也不容易获取高效富集的胎儿游离DNA。

随着无创产前诊断技术的发展，临床研究和诊断应用已经不能满足于利用母体血浆中胎儿DNA的进行相关疾病的风险预测，而对一些遗传病的诊断需求也日益迫切，如果从母体血浆中将微量的胎儿DNA进行高效的物理分离也是进行胎儿产前遗传病诊断的前提之一。

因此迫切需要发展一种新的高效、准确、能够实现胎儿DNA物理分离的方法。

发明内容

发明目的：本发明所要解决的技术问题是提供一种孕妇外周血胎儿DNA的富集方法。

技术方案：为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：一种孕妇外周血胎儿DNA的富集方法，所述富集方法包括以下步骤：

1)收集孕妇外周血，利用抗凝管储存，离心分离上层血浆；

2)分离步骤1)的血浆中的外泌体；

3)将洗好的抗体磁珠于离心管内(将清洗好的标记有通用二抗的磁珠(二抗磁珠)置于洁净的离心管中)，加入胎儿特异性抗体，温和倾斜并旋转孵育得到有特异性修饰的抗体磁珠；

4)在步骤2)分离的血浆外泌体悬液中加入包被有特异性修饰的抗体磁珠，混匀，旋转孵育30-60min得到反应液；

5)将步骤4)中的反应液用磁力架对磁珠进行吸附，吸弃反应液，然后用PBS缓冲液清洗一次，在磁力架吸附的状态下，吸弃上清；

6)在步骤5)处理后的磁珠上加入洗脱液，脱离磁力架，混匀，室温放置，收集洗脱液即为胎儿外泌体溶液；

7)提取胎儿外泌体溶液中的DNA即得。

其中，所述步骤3)中胎儿特异性抗体为包括但限于PLAP、HLA-G、CK-7等。

其中，所述步骤3)中的胎儿特异性抗体和抗体磁珠的质量体积比为(0.4～40)∶50μg/μL。

其中，所述步骤3)中的孵育时间为30～60min。

其中，所述步骤4)中血浆外泌体悬液与包被有特异性修饰的抗体磁珠的的体积比40∶1。

其中，所述步骤5)中的吸附时间1～2h。