[发明专利]一种基于外源饱和脂肪酸添加的纳他霉素发酵工艺

说明书

本发明公开了一种基于外源饱和脂肪酸添加的纳他霉素发酵工艺，通过添加对细胞没有任何毒副作用的缓释前体来源——饱和脂肪酸，其在细胞内进行β氧化利用时将产生大量乙酰CoA前体和NADH，从而保障纳他霉素大环内酯前体和ATP的供应，促进产物合成。由于饱和脂肪酸常温下呈固态，且不溶于水，其浓度不会影响发酵液中的细胞生长和代谢，因此本工艺中不需要进行严格的饱和脂肪酸浓度控制。本方法能够有效提高纳他霉素的生物合成水平，并大幅降低在发酵液中精密调控前体浓度的检测和补料操作负荷，在工业上具有重要的应用价值。

技术领域

本发明涉及一种促进纳他霉素合成的方法，具体地说是一种基于外源饱和脂肪酸添加的纳他霉素发酵工艺，属于工业生物技术领域。

背景技术

纳他霉素(Natamycin)是一种多烯大环内酯类抗真菌剂，目前其生产主要由链霉菌属产生菌(恰塔努加链霉菌、褐黄孢链霉菌、利迪链霉菌和纳塔尔链霉菌等)通过液态深层发酵来实现。纳他霉素能结合真菌细胞膜上的甾醇类基团，从而使真菌细胞膜发生畸变而破裂，故对霉菌、酵母等真菌具有强烈的抑制作用。近30年来，纳他霉素凭借着其极高的安全性(FDA,§172.155,1994)，在真菌类疾病治疗、食品防腐保鲜等领域发挥了重要的作用，具有应用范围广、市场需求大、绿色安全的优点。然而，目前纳他霉素的生产成本过高(市售￥850kg^-1)，这极大的限制了其工业化和市场化进程。如何通过改进发酵工艺来提升纳他霉素的发酵水平已然成为产业界追求的目标。

纳他霉素是一种微生物次级代谢产物，其分子中的关键结构——大环内酯环由多个乙酸单位和一个丙酸单位聚合形成，而在生命体中直接提供这些单位的是乙酰CoA和丙酰CoA。在纳他霉素生物合成领域，已有通过外源添加前体物质(乙酸、丙酸、丙醇等)的方式促进纳他霉素合成的研究。然而，值得注意的是，以上添加的前体物质在发酵液中大多不能超过5g/L，一旦超过该限度，细胞生长和纳他霉素合成能力将大幅下降。事实上，抗生素发酵生产中添加分子前体由来已久，适量的前体添加往往能够大幅强化抗生素的合成水平。而由于前体往往对细胞具有一定的毒性，或易引发反馈抑制作用，因此其添加工艺中最大的问题在于如何实时检测发酵液中的低浓度前体，并对其进行精密的补料控制。显然，在大规模微生物工业发酵生产中是很难实现低剂量成分的精密控制的。

油脂类底物常常在发酵中发挥着重要的作用。油脂是一种良好的氧载体，可以加速氧气在发酵液体系的溶解，降低氧气的传递阻力，提高传氧能力。另外，油脂水解后产生的甘油和脂肪酸均是良好的碳源，其中脂肪酸可被部分微生物经β氧化代谢分解成乙酰CoA，从而为大环内酯结构提供前体。研究表明，外源添加植物油可大幅提高泰乐菌素的发酵水平，而在纳他霉素发酵中，外源添加的植物油往往无法被产生菌利用，而仅仅作为氧载体来改善氧气的转递。若能对油类底物进行处理，使其作为碳源而在纳他霉素生物合成中使用，将大大提高纳他霉素生物合成中的乙酰CoA前体供应能力，避免直接添加前体带来的细胞毒性和反馈抑制作用。

发明内容

为提高纳他霉素发酵水平，降低直接添加前体的细胞毒性、反馈抑制和调控操作负荷，本发明提供了一种基于外源饱和脂肪酸添加的纳他霉素发酵工艺。本发明针对直接添加乙酸等前体物质容易产生的细胞毒性、反馈抑制的问题，开发出一种以褐黄孢链霉菌Z8(Streptomyces gilvosporeusZ8)为生产菌，利用葡萄糖和饱和脂肪酸双碳源进行纳他霉素合成的方法。本发明方法不仅可提高纳他霉素发酵产量，还可大幅减少前体添加中的调控难度，在纳他霉素生物合成中具有重要的工业应用价值。

本发明通过外源饱和脂肪酸添加的方式来提高纳他霉素生物合成水平。本工艺的特点在于添加对细胞没有任何毒副作用的缓释前体来源——饱和脂肪酸，其在细胞内进行β氧化利用时将产生大量乙酰CoA前体和NADH，从而保障纳他霉素大环内酯前体和ATP的供应，促进产物合成。由于饱和脂肪酸常温下呈固态，且不溶于水，其浓度不会影响发酵液中的细胞生长和代谢，因此本工艺中不需要进行严格的饱和脂肪酸浓度控制。本方法能够有效提高纳他霉素的生物合成水平，并大幅降低在发酵液中精密调控前体浓度的检测和补料操作负荷，在工业上具有重要的应用价值。