[发明专利]一种具有增强免疫活性的青蛤多糖及其制备方法和应用

权利要求书

1.一种具有增强免疫活性的青蛤多糖，其特征在于，所述青蛤多糖的主链由→4)-α-D-Glcp(1→构成，所述青蛤多糖结构中→4)Glc(1→和→4,6)Glc(1→的比例为6.8:1，分子量为380KDa，多糖的单糖组成为甘露糖:葡萄糖＝1:35。

2.一种如权利要求1所述具有增强免疫活性的青蛤多糖的制备方法，其特征在于，包括步骤：

S1、制备脱脂粉：取青蛤肉冻干后破碎成青蛤粉，使用丙酮对所述青蛤粉进行脱脂，干燥得脱脂粉；

S2、酶解：取步骤S1所述脱脂粉，每克脱脂粉中加入2～5mL 0.05mol/L的半胱氨酸-EDTA二钠溶液和15～25mL 0.05mol/L、pH＝8的K₂HPO₄缓冲液，再加入胰蛋白酶，37℃、100～150rpm振荡酶解2～5h，得混合溶液1；向所述混合液1中加入木瓜蛋白酶，65℃、100～150rpm振荡酶解1～5h得混合液2；

其中，所述胰蛋白酶的添加量为每克脱脂粉加入1250～7500U的胰蛋白酶；所述木瓜蛋白酶的添加量为每克脱脂粉加入10000～60000U的木瓜蛋白酶；

S3、灭酶：将步骤S2所述混合液2加热，使酶失活，冷却到室温，离心取上清液；

S4、络合沉淀：向步骤S3所述上清液中加入质量百分浓度0.1％～15％的氯化十六烷基吡啶溶液，室温放置2～48h，离心取沉淀1；

其中，所述质量百分浓度0.1～15％氯化十六烷基吡啶溶液的添加量为：以步骤S2所述脱脂粉的添加量为参照，每克脱脂粉对应添加1～2mL质量百分浓度0.1～15％氯化十六烷基吡啶溶液；

S5、醇沉：取步骤S4所述沉淀1，每克沉淀1溶解于10～20mL NaCl-乙醇混合溶液，再加入25～35mL体积分数70％～100％乙醇溶液，4℃放置2h以上，离心取沉淀2；

其中，所述NaCl-乙醇混合溶液为1～5mol/L NaCl溶液和体积分数70％～100％乙醇以体积比100:15混合所得溶液；

S6、除杂质：将步骤S5所述沉淀2用乙醇洗涤，然后经过透析除盐，得粗糖溶液；

S7、冻干：取步骤S6所述粗糖溶液冻干得到青蛤粗糖；

S8、纯化：将步骤S7所述青蛤粗糖溶解于去离子水，使用DEAE-纤维素柱纯化，依次用去离子水、0.01M NaCl、0.02M NaCl和0.05M NaCl溶液各洗脱2～5个柱体积，收集0.05M NaCl溶液洗脱部分，经透析后冻干，得到青蛤多糖。

3.根据权利要求2所述具有增强免疫活性的青蛤多糖的制备方法，其特征在于步骤S1所述制备脱脂粉具体为：取青蛤肉冻干，所述冻干条件为：冻干机冷阱温度-60℃，真空度1～10Pa，所述青蛤肉冻干时间≥4h；将冻干后的青蛤破碎成青蛤粉，按料液比3:10g/ml向所述青蛤粉中加入丙酮，100～500rpm搅拌0.5～2h，静置2～24h，去除上层丙酮，所得沉淀干燥至质量恒定，得脱脂粉。

4.根据权利要求2所述具有增强免疫活性的青蛤多糖的制备方法，其特征在于，步骤S3所述灭酶具体为：将所述混合液2置于100℃加热2～10min，4～30℃、3000～10000r/min离心5～60min，取上清液。

5.根据权利要求2所述具有增强免疫活性的青蛤多糖的制备方法，其特征在于，步骤S4所述离心具体为：4～30℃、3000～10000r/min离心5～60min。

6.根据权利要求2所述具有增强免疫活性的青蛤多糖的制备方法，其特征在于，步骤S5所述离心为：3000～15000r/min离心5～60min。