[发明专利]一种外囊泡的表征方法

说明书

本发明提供了一种外囊泡的表征方法，所述方法采用蛋白质荧光染料和细胞膜荧光染料进行双重荧光染色，通过流式细胞仪获取外囊泡的多参数，实现评估表征；本发明通过将蛋白质荧光染料和细胞膜荧光染料相结合，优化实验步骤和条件，应用于流式细胞仪检测生物样品中外囊泡，拓宽了荧光染料的新用途，基于蛋白质荧光染料和细胞膜荧光染料的双重染色在评估外囊泡中具有较好的效果。

技术领域

本发明涉及生物化学领域，主要涉及一种外囊泡的表征方法，尤其涉及一种微囊泡或/和外泌体的表征方法。

背景技术

细胞外囊泡(extracellular vesicle，EVs)是指细胞膜上脱落或者由细胞分泌的双层膜结构的囊泡状小体，直径从30nm到1000nm不等。细胞外囊泡主要由微囊泡(microvesicle)和外泌体(exosome)组成。微囊泡是细胞激活、损伤或凋亡后从细胞膜脱落的小囊泡，直径约为100nm–1000nm。外泌体由细胞内的多泡小体(Multivesicular bodies)与细胞膜融合后以外分泌的形式释放到细胞外，直径约为30nm-100nm。几乎所有类型的细胞，包括癌细胞都会释放外泌体。作为细胞间通讯的重要介质，外泌体介导了蛋白质和遗传物质的转运和交换。

目前细胞外囊泡(EVs)的检测方法主要有扫描电子显微镜(SEM)、原子力显微镜(AFM)、动态光散射技术(DLS)、纳米微粒追踪分析术(NTA)、流式细胞仪和酶联免疫分析(ELISA)等，由于动态光散射技术和纳米微粒追踪分析术仅能表征生物样品的物理参数；而扫描电子显微镜、原子力显微镜的样品前处理步骤复杂且对操作人员的经验要求较高；由于通量高、用时短、操作简单，酶联免疫分析和流式细胞仪已成为目前较常用的方法。酶联免疫分析方法容易受其他可溶性抗原的干扰，而且无法知道囊泡的大小、数量等信息；流式细胞仪可以检测囊泡的大小、数量，因理论上是进行囊泡快速、高通量、多参数检测的最优选择。但纳米流式仪造价高昂，不利于在医院和疾病检测中心的应用和推广；到目前为止以上技术也未在医疗领域中得到广泛应用。

因此，研发一种简洁高效、适用于常规流式细胞仪，用于表征评估外泌体或/和微囊泡的检测方法，具有广阔的应用前景和巨大的市场价值。

发明内容

针对现有技术的不足和市场的需求，本发明提供了一种外囊泡的表征方法，通过将蛋白质荧光染料和细胞膜荧光染料相结合，应用于流式细胞仪检测生物样品中外泌体或/和微囊泡，拓宽了荧光染料的新用途，在评估外囊泡中具有较好的效果。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

第一方面，本发明提供一种外囊泡的表征方法，所述方法采用蛋白质荧光染料和细胞膜荧光染料进行双重荧光染色，通过流式细胞仪检测并获取外囊泡的多参数，实现生物样品的评估表征。

现有技术中，鉴定微囊泡和外泌体的方法是纳米流式和扫描电子显微镜、原子力显微镜、动态光散射技术、纳米微粒追踪分析术、流式细胞仪和酶联免疫分析，但纳米微粒追踪分析术和酶联免疫分析的方法只能表征样品的物理参数；而扫描电子显微镜、原子力显微镜虽然可以表征样品的生物结构，对样品和操作人员的要求较高；纳米流式仪是针对于外囊泡而专门研发的流式仪，目前仪器购置成本高；以上因素均严重限制了外囊泡表征方法的发展与推广。本方法采用胞内通用型酯酶的蛋白质荧光染料和通用型细胞膜荧光染料的双重染色，通过流式细胞仪来获取微囊泡和外泌体的多参数，用以其特征的评估。

优选地，所述外囊泡包括外泌体或/和微囊泡。