[发明专利]一种外囊泡的表征方法

权利要求书

1.一种外囊泡的表征方法，其特征在于，所述方法采用蛋白质荧光染料和细胞膜荧光染料进行双重荧光染色，通过流式细胞仪获取外囊泡的多参数，实现评估表征；

所述蛋白质荧光染料包括羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯CFSE；

所述细胞膜荧光染料包括亲脂性羰花青染料Dil或/和十八烷基罗丹明B氯盐；

所述羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯CFSE的工作浓度为10-80nM；

所述亲脂性羰花青染料Dil的工作浓度为0.5-2nM。

2.根据权利要求1所述的表征方法，其特征在于，所述外囊泡包括外泌体或/和微囊泡。

3.根据权利要求1所述的表征方法，其特征在于，所述细胞膜荧光染料为亲脂性羰花青染料Dil。

4.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

(1)分离提取外囊泡；

(2)将羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯CFSE与外囊泡混合后避光孵育染色；

(3)将步骤(2)孵育染色后的产物加入亲脂性羰花青染料Dil，避光孵育染色；

(4)将步骤(3)孵育染色后的产物稀释后进行流式细胞仪检测，收集数据并分析。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述孵育的温度为35℃-37℃；

步骤(2)所述孵育的时间为0.2-3h。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述孵育的条件为23℃-26℃孵育10-30min或35℃-37℃孵育1-15min。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述孵育的条件为23℃-26℃孵育10-30min。

8.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(4)所述稀释的倍数为10-1000倍。

9.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，具体包括如下步骤：

(1)分离提取外囊泡；

(2)将工作浓度为10-80nM的羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯CFSE与外囊泡混合后避光35℃-37℃孵育0.2-3h染色；

(3)将步骤(2)孵育染色后的产物加入工作浓度为0.5-2nM的亲脂性羰花青染料Dil，避光孵育染色，23℃-26℃孵育10-30min或35℃-37℃孵育1-15min；

(4)将步骤(3)孵育染色后的产物稀释10-1000倍后进行流式细胞仪检测，收集数据并分析。

10.一种包括羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯CFSE和亲脂性羰花青染料Dil的组合物用于外囊泡的双重荧光染色的应用；

所述羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯CFSE的工作浓度为10-80nM；

所述亲脂性羰花青染料Dil的工作浓度为0.5-2nM。

11.根据权利要求10所述的应用，其特征在于，所述外囊泡为外泌体或/和微囊泡。

12.根据权利要求11所述的应用，其特征在于，所述应用包括评估外囊泡的有效浓度、外囊泡样品完整性和生物活性、细胞外囊泡的粒径范围或样品中杂质含量中的任意一种或至少两种的组合；

所述杂质包括蛋白质聚合物和脂类化合物。

13.根据权利要求11所述的应用，其特征在于，所述应用包括表征生物样品中外泌体或/和微囊泡结构的完整率或/和破损率。