[发明专利]一种测定环境样品中痕量沙丁胺醇的方法

说明书

本发明公开了一种测定环境样品中痕量沙丁胺醇的方法，包括材料与试剂准备，缓冲溶液制备，仪器选择，制备Eu³⁺标记的山羊抗兔抗体，在CBS中用涂层抗原覆盖微孔板并孵育，用OVA在TBS中培养以阻断微孔板，加入甲醇标准溶液和PBS稀释的多克隆抗体，加入在PBS中稀释的Eu³⁺标记抗体孵育，添加增强溶液，机械振荡后，用微量滴定仪在340nm激发波长、615nm发射波长、延迟时间100μs、400μs窗口时间下测定荧光强度。本发明的有益效果是方法具有较高的灵敏度和检测能力，该方法重现性好，回收率高，可满足残留分析的要求。

技术领域

本发明属于化学测定技术领域，涉及一种高灵敏度时间分辨荧光免疫分析法测定环境样品中痕量沙丁胺醇的方法。

背景技术

兽药在保护畜牧养殖业中发挥着重要作用。然而，兽药和饲料添加剂的广泛使用已成为环境污染和危害人类健康的重要因素(Bártíková等，2016；Emanuela等，2019)。沙丁胺醇(salbutamol，SAL)，一种肾上腺素受体激动剂，在家畜生产中经常被作为“瘦肉剂”非法滥用。研究表明SAL对人的心脏、肝脏和肾脏有一定的毒性(Susan，1994；Khirani等，2016年)。虽然SAL在许多国家已被严格禁止用作促进生长的饲料添加剂，但它仍然被广泛用作临床药物(zhang等，2017；Marchant-Forde等，2012)。此外，SAL还可以通过动物粪便和尿液进入生态环境，造成环境污染，并可能通过食物链进入人体。作为一种污染物，SAL广泛存在于环境中(Andrea等，2016)，特别在一些水质中，其浓度甚至高达0.47μg/L(Jonathan，Nikolaos，2006)。因此，有必要建立一种合适的检测方法来监测环境中的SAL。

目前，已开发的检测SAL的分析方法有仪器测量(Rosales-Conrado等，2013；Zhang等，2012；Yang等，2012年)、生物传感器(Wang等，2013；Li等，2013；Wang等，2015)。仪器测量成本高、耗时长，不适合分析大量样品。生物传感器具有较低的检测限，但其稳定性和再现性相对较差。免疫分析是一种快速、低成本和高通量的分析方法，已成功应用于检测SAL(Li等，2013；Gao等，2014；Lei等，2015)。然而，这些免疫分析主要集中于动物产品、饲料和尿液中的SAL检测，很少应用于环境样本(Xu等，2015；Li等，2017)。此外，环境中的SAL通常处于痕量水平，因此检测方法需要更高的灵敏度以满足环境监测的需要。

发明内容

本发明的目的在于提供一种测定环境样品中痕量沙丁胺醇的方法，本发明的有益效果是方法具有较高的灵敏度和检测能力，该方法重现性好，回收率高，可满足残留分析的要求。

本发明所采用的技术方案是按照以下步骤进行：

1.材料与试剂：

95％纯度的沙丁胺醇SAL，牛血清蛋白BSA，卵清蛋白OVA，亲和纯化山羊抗兔抗体，3，3′，5，5′-四甲基联苯胺TMB、聚氧乙烯山梨糖醇单月桂酸酯TWEN-20，异硫氰酸苄基二亚乙基三胺四乙酸铕DTTA-Eu³⁺。

缓冲溶液：封闭缓冲液，磷酸盐缓冲液PBS，0.01mol/L，pH＝7.4；包被缓冲液，碳酸盐缓冲液CBS，0.05mol/L，pH＝9.6；Tris-HCl缓冲液TBS，0.05mol/L，pH＝7.8，含0.01％氯化钠；PBS，含0.05％吐温-20PBST；TMB溶液，含0.4mmol/L，TMB，柠檬酸缓冲液，含3mmol/LH₂O₂，pH＝5.0；荧光增强液，0.1mol/L，含15μmol/Lβ-萘三氟丙酮和0.1％Triton X-100的双邻苯二甲酸钾缓冲液，pH＝3.2；土样提取液，9mL的0.2mol/LHCl-甲醇，v:v，1:4和1mL乙酸铅饱和溶液；